在小鼠衰老模型中白藜蘆醇對(duì)其腦組織形態(tài)、海馬細(xì)胞周期以及氧化應(yīng)激水平的干預(yù)研究.pdf

1、前言
　　人口老齡化一直成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。2010年我國(guó)第六次全國(guó)人口普查數(shù)據(jù)顯示，60歲以上人口占總?cè)丝诘?3.26％，達(dá)1.77億人，比2000年上升2.9個(gè)百分點(diǎn)，占全世界老齡人口的1/5，成為世界上唯一的老齡人口過(guò)億的國(guó)家。老齡人口的數(shù)量和生活質(zhì)量關(guān)系到一個(gè)國(guó)家未來(lái)的發(fā)展，它的影響涉及到社會(huì)的方方面面，其不僅消耗了國(guó)家經(jīng)濟(jì)發(fā)展的成果，而且也給社會(huì)和家庭造成了嚴(yán)重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，研究老年人群的健康及其干預(yù)措

2、施具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
　　人口的老齡化促使人們更加關(guān)注與衰老相關(guān)因素的研究，其中腦衰老已成為醫(yī)學(xué)重要的研究課題之一。腦衰老是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，為多種因素共同作用導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)與功能的改變，其最重要的表現(xiàn)是學(xué)習(xí)和記憶能力的減退。自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為:代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子(ReactiveOxygenSpecies，ROS)引發(fā)的氧化性損傷隨著年齡的增長(zhǎng)而加劇，當(dāng)損傷積累的程度超過(guò)自身抗氧化防御體系修復(fù)程度時(shí)，最終導(dǎo)致

3、衰老，主要表現(xiàn)為抗氧化酶活性的降低以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的增多。腦具有耗氧量大、ROS消除系統(tǒng)水平低、產(chǎn)生的途徑多于其他系統(tǒng)或器官的生物學(xué)特征，致使大腦成為ROS最易侵襲的靶器官。
　　流行病學(xué)資料調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，增加蔬菜、水果的攝入量能夠顯著降低心血管疾病、腫瘤等慢性病的發(fā)病率及死亡率。體外一些實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)許多蔬菜、水果對(duì)ROS有顯著清除作用。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是近年來(lái)備受關(guān)注且研究較多的植物化學(xué)物，主要存在于葡

4、萄、花生、藜蘆等72種植物中，屬于非黃酮類多酚化合物。目前研究發(fā)現(xiàn)，Res具有廣泛的生物學(xué)作用，如抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)、心血管保護(hù)作用等。近來(lái)有研究顯示Res能夠減輕小鼠缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)損傷，以及對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元有保護(hù)作用等，而關(guān)于Res對(duì)動(dòng)物衰老模型腦組織形態(tài)及海馬細(xì)胞保護(hù)作用的研究還不多見(jiàn)。
　　綜上所述，本研究結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用兩個(gè)劑量(22.5mg/kg.bw.d和45mg/kg.bw.d)的Res對(duì)D-半乳

5、糖(D-galactose，D-gal)誘導(dǎo)的小鼠衰老模型進(jìn)行干預(yù)，觀察Res對(duì)其腦組織形態(tài)、海馬細(xì)胞周期以及氧化應(yīng)激水平的影響，并初步探討可能的機(jī)制。
　　材料和方法
　　一、動(dòng)物的分組與喂養(yǎng)
　　16w齡SPF級(jí)雄性昆明種小鼠72只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，按體重隨機(jī)分為基礎(chǔ)組、衰老組、干預(yù)Ⅰ組、干預(yù)Ⅱ組，每組18只。基礎(chǔ)組每日頸背部皮下注射生理鹽水，其余三組注射200mg/kg.bw.d的D-gal溶液?；A(chǔ)組和衰老組

6、每日給予0.5％的羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，干預(yù)Ⅰ組和干預(yù)Ⅱ組分別給予相應(yīng)濃度的Res溶液灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，各組小鼠自由攝食、飲水，自然光照，室溫20℃～24℃，濕度40％～70％，每周稱量體重2次，干預(yù)16w。
　　二、測(cè)定指標(biāo)及方法
　　實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到16w木時(shí)，每組分別取18只小鼠測(cè)定相應(yīng)的指標(biāo):
　　（一）一般狀態(tài)觀察
　　觀察各組小鼠一般狀態(tài)，包括攝食、飲水、活動(dòng)、毛色、光澤度等方面變化。
　?。ǘ┠X系

7、數(shù)測(cè)定
　　每組隨機(jī)取12只小鼠乙醚麻醉后處死，取出腦組織，生理鹽水洗凈后稱重，按公式計(jì)算腦系數(shù):
　　腦系數(shù)(mg/g)=腦質(zhì)量(mg)/體重(g)
　?。ㄈ┠X組織形態(tài)觀察
　　將每組剩余的6只小鼠，乙醚麻醉下開(kāi)腹，灌注固定，灌注完畢后斷頭取腦，矢狀面切取腦組織0.1cm，置于4％多聚甲醛中再固定24h，制成HE切片，在顯微鏡下觀察腦組織病理改變。
　?。ㄋ模┖ｑR細(xì)胞周期檢測(cè)
　　取12只小鼠50

8、％腦的海馬，置于冰凍PBS中剪碎，洗三次，加入0.25％胰酶1ml，37℃恒溫水浴30min，消化腦組織，加入DMEM（含10％小牛血清）3ml停止消化，過(guò)200目篩網(wǎng)，回收平皿中液體到5mlEP管，低溫離心，棄上清，加PBS1ml，轉(zhuǎn)移到2mlEP管內(nèi)，再次離心，棄上清，制備海馬組織單細(xì)胞懸液。加入1ml70％乙醇，4℃固定12h。取出固定的細(xì)胞，低溫離心，棄上清，加PBS1ml，再次離心，棄上清，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色及上機(jī)檢測(cè)。

9、結(jié)果用細(xì)胞指數(shù)及增殖指數(shù)(proliferationindex，PI)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100％
　　（五）腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及MAO活性測(cè)定
　　用生理鹽水將另外50％腦制成10％腦勻漿液，分別按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腦谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GSH-px)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、過(guò)氧

10、化氫酶(Catalase，CAT)、單胺氧化酶（Monoamineoxidase，MAO）活性和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，并采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。
　　三、數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析
　　實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(X)±S表示，用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。
　　結(jié)果
　　一、一般狀態(tài)觀察結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)期間，衰老

11、組小鼠與基礎(chǔ)組相比，行動(dòng)遲緩，毛色發(fā)黃，漸有脫毛現(xiàn)象，干預(yù)組狀態(tài)好于衰老組。
　　二、腦系數(shù)測(cè)定結(jié)果
　　衰老組低于基礎(chǔ)組，干預(yù)組高于衰老組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干預(yù)組與基礎(chǔ)組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)Ⅱ組與干預(yù)Ⅰ組比較，小鼠腦系數(shù)未見(jiàn)明顯改變（P＞0.05）。各組小鼠體重及腦重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　三、腦組織形態(tài)觀察結(jié)果
　　從神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)方面來(lái)看，衰老組

12、小鼠腦皮質(zhì)、海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生變性，細(xì)胞排列稀疏;干預(yù)組與衰老組相比，變性細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞間排列有序。從神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量方面來(lái)看，衰老組均低于基礎(chǔ)組，干預(yù)組均高于衰老組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，干預(yù)組與基礎(chǔ)組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。干預(yù)Ⅱ組與干預(yù)Ⅰ組比較，小鼠神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)。
　　四、海馬細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果
　　與基礎(chǔ)組比較，衰老組及干預(yù)組G0/G1期百分率

13、升高，S期百分率降低，G2/M期百分率降低，增殖指數(shù)降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。與衰老組相比，干預(yù)組G0/G1期百分率降低，S期百分率升高，G2/M期百分率升高，增殖指數(shù)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。干預(yù)Ⅱ組與干預(yù)Ⅰ組比較，小鼠海馬細(xì)胞周期各期百分率及增殖指數(shù)未見(jiàn)明顯改變（P＞0.05）。
　　五、腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及MAO活性測(cè)定結(jié)果
　　與基礎(chǔ)組相比，衰老組小鼠腦組織GSH-P

14、x、SOD、CAT活性均降低，MAO活性、MDA含量均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），干預(yù)組小鼠的相應(yīng)指標(biāo)均未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)。與衰老組相比，干預(yù)組小鼠腦組織GSH-Px、SOD、CAT活性均升高，MAO活性、MDA含量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干預(yù)Ⅱ組與干預(yù)Ⅰ組比較，小鼠腦組織各氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1、Res可減緩衰老模型小鼠腦系數(shù)的下降。