斯氏貍殖吸蟲排泄分泌產(chǎn)物免疫活性分析及免疫診斷應(yīng)用.pdf

1、目的:分析斯氏貍殖吸蟲童蟲、成蟲排泄分泌產(chǎn)物(Excretory secretoryproducts,ESP)的蛋白分子量和抗原性,并對(duì)兩者進(jìn)行免疫組織定位,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察其活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的類型。以ESP為特異診斷抗原,制備膠體金免疫層析試紙條,建立一種快速診斷并殖吸蟲病的免疫診斷方法。
　　 方法:(1)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離斯氏貍殖吸蟲童蟲ESP、蟲體可溶性蛋白和成蟲ESP、蟲體可

2、溶性蛋白,采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)技術(shù)分別用肺吸蟲病人血清、小鼠感染血清識(shí)別特異性反應(yīng)條帶,并用酶標(biāo)免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)ESP進(jìn)行組織定位。(2)蟲體抗原皮下免疫BALB／c小鼠,腹腔注射童蟲ES抗原后不同的時(shí)間點(diǎn)收集腹腔巨噬細(xì)胞。用異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的抗鼠甘露糖受體(Mannose Receptor,MR,又稱CD206)抗體識(shí)別巨噬細(xì)胞上的膜受體,通過(guò)

3、共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞表面熒光強(qiáng)度。半定量PCR分析誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible NO synthase,iNOS),精氨酸酶(arginase-1),CD206的基因表達(dá)情況。(3)還原法制備膠體金溶液,并用透射電子顯微鏡和紫外可見分光光度儀對(duì)膠體金顆粒的粒徑、聚集情況、與兔抗人IgG的結(jié)合情況進(jìn)行檢測(cè),制備出均勻的、分散的高質(zhì)量膠體金。用斯氏貍殖吸蟲ES抗原和葡萄球菌A蛋白噴于帶背襯的硝酸纖維素膜,分別作為檢測(cè)線、質(zhì)控線。用

4、膠體金標(biāo)記的兔抗人IgG去檢查病人血清中的抗體。
　　 結(jié)果:(1)經(jīng)SDS-PAGE分離斯氏貍殖吸蟲的蟲體可溶性蛋白和ESP,Western blot分析顯示,病人血清識(shí)別的童蟲ESP主帶在28、70kDa,成蟲ESP主帶在90kDa處；小鼠感染血清識(shí)別的童蟲ESP主帶在28、70kDa,成蟲ESP主帶在45、70kDa處。童蟲ESP主要定位在后尾蚴的排泄囊,成蟲ESP主要定位在成蟲腸腔上皮。(2)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到活化巨

5、噬細(xì)胞表面綠色熒光,且在第3天時(shí)熒光值最強(qiáng)。RT-PCR檢測(cè)到ESP活化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞有arginase-1、CD206基因表達(dá),但不表達(dá)iNOS。(3)用膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)肺吸蟲病血清54份,健康人血清34份,其敏感性是94.44％(51／54)特異性是94.22％(32／34),與ELISA檢測(cè)法相比沒(méi)有就較大差異。檢測(cè)血吸蟲病人血清25份和肝吸蟲病人血清15份,其交叉反應(yīng)率分別為4％(1／25)和6.67％(1／15)。試