Narf及其同源基因Narl結(jié)構(gòu)功能的初步研究.pdf

1、背景與目的：世界人口正面臨嚴重的老齡化問題，中國也逐步步入老年社會，衰老機理的研究及老年性疾病的診斷和預(yù)防顯得十分緊迫和重要。通常機體老化是緩慢漸進的，利用一些基因突變引起的早衰模型來研究正常衰老過程的分子機制具有重要的現(xiàn)實意義。酵母細胞培養(yǎng)容易，繁殖迅速，特別是存在眾多的突變體，因而成為衰老研究的理想模型。A型核纖層蛋白前體(prelamin A)C末端不能被剪切或異常剪切50個氨基酸殘基均導(dǎo)致細胞出現(xiàn)衰老表型，說明其C末端對細胞的衰

2、老進程有重要影響，prelamin A特異識別因子Narf在該過程中可能起著重要作用，與細胞衰老密切相關(guān)。本研究在已經(jīng)證明Narf與prelamin A相互作用的基礎(chǔ)上，進一步研究Narf的細胞定位以及其與prelamin A結(jié)合的區(qū)域，為其功能研究奠定基礎(chǔ)。通過構(gòu)建Narf在釀酒酵母中的同源基因Narl基因敲除突變株，探討了Narl在酵母細胞衰老和生長過程中的功能。
　　 方法：將本實驗室構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Na

3、rf單獨轉(zhuǎn)染或與pDsRed1-N1-prelamin A共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的定位情況；采用PCR方法擴增得到Narf不同區(qū)域的片段，插入到pACT2載體上構(gòu)建一系列重組質(zhì)粒，與已構(gòu)建的含prelamin A cDNA的BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株，篩選能夠發(fā)生相互作用的區(qū)域；利用同源重組的方法構(gòu)建Narl基因缺失的酵母突變株，并分析其對酵母的壽命和生長的影響。
　　 結(jié)果：Narf蛋白定位于

4、細胞核中，并呈現(xiàn)點狀高表達的現(xiàn)象，但當同時轉(zhuǎn)染prelamin A時，Narf蛋白則主要與prelamin A共定位于核周，且點狀高表達現(xiàn)象消失；Narf蛋白的C末端缺失對prelamin A與Narf的相互作用沒有影響；NARl/narl基因缺失突變雜合菌株的壽命縮短且抗氧化應(yīng)激能力下降。
　　 結(jié)論：Narf蛋白與prelamin A蛋白在HEK293細胞中存在共定位，進一步說明它們在體內(nèi)存在相互作用。Narlp在酵母的壽命