端粒蛋白Tankyrase和TRF1的研究.pdf

1、衰老，同生長(zhǎng)一樣，是細(xì)胞的重要生命現(xiàn)象之一。端粒具有穩(wěn)定染色體的功能，端粒長(zhǎng)度是控制細(xì)胞衰老的“分子鐘”，是細(xì)胞衰老、死亡和癌變的重要標(biāo)志。 端粒酶和端粒蛋白對(duì)端粒長(zhǎng)度具有調(diào)節(jié)作用。人端粒結(jié)合蛋白(telomererepeatbindingfactor1，TRF1)能夠以二聚體的形式通過(guò)其羧基端的myb結(jié)構(gòu)域與端粒DNA結(jié)合，強(qiáng)化端粒的有序結(jié)構(gòu)，使其處于一種“關(guān)閉”狀態(tài)，導(dǎo)致端粒酶無(wú)法接近端粒末端發(fā)揮作用，過(guò)表達(dá)的TRF1能使端

2、粒長(zhǎng)度逐漸縮短，它是端粒長(zhǎng)度的負(fù)調(diào)節(jié)因子。同時(shí)，長(zhǎng)期過(guò)表達(dá)的端錨聚合酶(TRF1-interacting，ankyrin-relatedADP-ribosepolymerase，tankyrase)與TRF1分子結(jié)合后，通過(guò)其PARP活性對(duì)TRF1進(jìn)行聚ADP-核糖基化修飾，阻斷TRF1與端粒DNA的結(jié)合，從而解除TRF1對(duì)端粒長(zhǎng)度的抑制作用，使端粒處于一種“開(kāi)放”的狀態(tài)，使端粒長(zhǎng)度逐漸延長(zhǎng)。因此tankyrase酶活性的調(diào)節(jié)及其與TR

3、F1的相互作用可能是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控端粒長(zhǎng)度的重要方式。 TRF1具有核定位信號(hào)，是一個(gè)典型的核蛋白，而tankyrse則在胞漿和胞核都有分布，并且它在胞核的分布依賴(lài)于TRF1。它們是通過(guò)什么機(jī)制精細(xì)地調(diào)節(jié)端粒的長(zhǎng)度?這一過(guò)程中是否還有其它分子對(duì)它們進(jìn)行修飾或調(diào)控?如果抑制tankyrase的蛋白表達(dá)水平，封閉其功能，阻斷它與TRF1之間的相互作用，是否會(huì)強(qiáng)化TRF1對(duì)端粒長(zhǎng)度的負(fù)向調(diào)控功能?反之，如果抑制TRF1的表達(dá)水平是否會(huì)強(qiáng)化

4、tankyrase的功能或是因?yàn)閠ankyrase的入核能力降低而削弱它的正向調(diào)節(jié)能力?所有的這些情況又將對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、端粒長(zhǎng)度和細(xì)胞衰老產(chǎn)生怎樣的影響? 為了對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行深入研究，我們的工作獲得如下結(jié)果： 1.通過(guò)RT-PCR從HeLa細(xì)胞中克隆得到TRF1蛋白編碼基因，誘導(dǎo)表達(dá)了帶His-tag的TRF1融合蛋白，用純化重組蛋白作為免疫原制備的兔抗血清能夠用于Western-blot和免疫熒光細(xì)胞染色檢測(cè)多種哺乳動(dòng)物

5、細(xì)胞內(nèi)源性TRF1分子。 2.通過(guò)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)與tankyrase結(jié)合的TRF1氨基端68個(gè)氨基酸序列，建立了負(fù)顯性抑制tankyrase胞核功能的細(xì)胞模型。 3.篩選得到兩個(gè)干涉tankyrase蛋白表達(dá)水平的siRNA序列，獲得了穩(wěn)定表達(dá)干涉siRNA序列的細(xì)胞株。 4.利用帶GFP-tag的TRF1重組載體，建立TRF1誘導(dǎo)HeLa和H460細(xì)胞凋亡的模型。 5.免疫共沉淀試驗(yàn)顯示：PKA和TRF1能

6、夠形成免疫沉淀復(fù)合物，PKA的體外磷酸化實(shí)驗(yàn)表明：PKA能夠?qū)RF1進(jìn)行磷酸化修飾，并且可被PKA的抑制劑H89所抑制。提示：TRF1可能是PKA的磷酸化底物。 6.通過(guò)瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染，篩選出兩條能夠顯著抑制過(guò)表達(dá)TRF1的siRNA序列，一條具有抑制作用的siRNA序列。 本研究建立的封閉tankyrase胞核功能的細(xì)胞模型和得到的干涉tankyrase及TRF1的siRNA序列，為深入理解tankyrase和TRF1之