Eimeria tenella表面抗原基因sag10和λMZP5—7在畢赤酵母中的表達.pdf

1、雞柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)主要寄生在宿主盲腸的粘膜下，引起出血性腸炎，致病力強，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展。目前使用抗球蟲藥是防治肉仔雞病的主要手段，但抗藥性和藥物殘留等問題限制了球蟲藥物的廣泛應用。研究表明重組球蟲抗原免疫雞后能產(chǎn)生一定的保護力，保護性抗原基因是其免疫功效的決定因素。球蟲表面抗原基因sag10、λMZP5-7是重要的候選基因之一。λMZP5-7的免疫保護作用已被證實，sag10基因在子孢子入侵和裂殖子

2、生殖階段均有表達，具有潛在的研究價值。本實驗目的是在甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母中表達Eimeriatenella表面抗原基因，為研制有效球蟲基因工程疫苗提供新的途徑。同時也為下一步進行免疫保護研究提供材料。 本文提取Eimeriatenella北京株第二代裂殖子總RNA，根據(jù)Genbank報道序列，編號L08257、AJ586552設計引物，應用RT-PCR技術(shù)擴增得到Eimeriatenella表面抗原基因λMZP5-7和sag10。

3、與pGEM-T載體連接后測序，結(jié)果λMZP5-7與報道序列完全一致共948bp，編碼315個氨基酸；pGEMT-sag10序列測定結(jié)果在NCBI上BLAST分析比較，結(jié)果表明，sag10基因編碼序列與文獻報道的序列同源性為99.01％，該球蟲表面抗原基因全長708bp，編碼236個氨基酸。其中有7個核苷酸與報道序列差異，4個氨基酸序列有差異。分別將λMZP5-7、sag10與真核表達載體pPIC9K連接，構(gòu)建了pPIC9K-MZP和pP

4、IC9K-sag10分泌型真核表達質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，利用G418抗性篩選多拷貝重組菌株，搖瓶水平進行誘導表達。SDS-PAGE和WesternBlot進行檢測，分別在大約36KD和43kD處有明顯的免疫印跡條帶，結(jié)果MZP、SAG兩種抗原蛋白得到表達，而且能被特異性抗體所識別，具有生物學活性。篩選到表達量最高的菌株S7在5L發(fā)酵罐進行優(yōu)化表達，隨著甲醇的誘導發(fā)酵上清中SAG10蛋白不斷累積，當誘導120h后生物量達到最高