抑制RAGE和galectin-3對apoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的作用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，系統(tǒng)性和/或局部的炎癥參與了從動脈粥樣硬化起始到斑塊破裂的全過程。致動脈粥樣硬化的眾多因素例如氧化應激、晚期糖基化終產物、高血壓和吸煙等都可導致血管內皮細胞的損傷，從而加速脂質的血管沉積、單核細胞向受損內皮遷徙黏附并進入內膜下轉化為巨噬細胞。單核細胞的聚集是動脈粥樣硬化啟動的重要環(huán)節(jié)，單核細胞可釋放多種前炎癥因子如：ICAM-1、VCAM-1、MCP-1和ILs等以促進其分化為巨噬細胞?；罨木奘杉毎煞置?/p>

2、多種炎癥因子放大炎癥反應，加速動脈粥樣硬化的進展。巨噬細胞還可分泌多種蛋白降解酶類如膠原酶和細胞外基質金屬蛋白酶等，從而降解纖維帽中膠原成分，導致斑塊不穩(wěn)定甚至破裂，最終產生嚴重的臨床后果如心肌梗死和腦梗塞等。
　　 晚期糖基化終產物受體(receptorofadvancedglycationendproducts，RAGE)參與了動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的過程。RAGE可通過調控ERK1/2、JNK和p38MAPK等信號傳導通路誘

3、導ICAM-1、VCAM-1和MCP-1及MMP-2和9的表達。RAGE還可以以下途徑參與和放大炎癥反應過程。一方面，RAGE和其配體結合活化后可通過刺激NF-κBP65的表達而持續(xù)增強NF-KB活性，進一步上調黏附、趨化因子及MMP-2和9的表達。另一方面，RAGE通過刺激產生活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)直接活化NF-κB通路。此外，RAGE的表達也受到ROS和NF-κB的調控。因此，抗氧化劑有可能通過

4、抑制RAGE和NF-κB的活性減輕炎癥反應并抑制動脈粥樣硬化的進展。既往的研究提示，AMPK激動劑WS070117和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)均具有抗氧化活性，但尚不清楚這兩種抗氧化劑是否具有抑制RAGE及其相關信號通路的作用。
　　 內皮細胞上的多種粘附因子如VCAM-1、ICAM-1等介導了單核細胞和內皮細胞之間的粘附，單核細胞與內皮下的細胞外基質(extracellularmatri

5、x，ECM)如層粘連蛋白、玻連蛋白、膠原Ⅰ和Ⅳ等相互作用而“錨定”在ECM，并分化為巨噬細胞。既往的研究證明，galectin-3參與了多種遷徙細胞（如多種腫瘤細胞、白細胞）與內皮之間的粘附，數(shù)種基質參與其中。首先，多種ECM成分如層粘連蛋白、纖連蛋白，MAC-2結合蛋白等可作為galectin-3的配體與其結合。其次，galectin-3作用于單核/巨噬細胞表面的CD98，活化一系列信號通路并與整聯(lián)蛋白結合。整聯(lián)蛋白尤其是αMp2與g

6、alectin-3結合后，直接促進巨噬細胞定位于內皮下的ECM。前期的實驗發(fā)現(xiàn)，可特異性結合galectin-3糖識別結合結構域的改良的柑橘果膠(modifiedcitruspectin，MCP)可抑制多種腫瘤細胞與內皮細胞的結合。但MCP是否也能抑制單核細胞與內皮細胞的結合至今尚未見報道。
　　 本論文主要分為兩個部分：第一部分研究AMPK激動劑WS070117和NAC對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展的作用，側重探討WS0

7、70117和NAC的抗氧化特性以及對NF-κB、RAGE及其相關信號通路的抑制作用。第二部分研究galectin-3抑制劑MCP在apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用。
　　 第一部分：
　　 AMPK激動劑WS070117和NAC對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展的作用
　　 目的：WS070117是一種新合成的AMPK激動劑，具有抗氧化的特性。我們分別用WS070117和NAC處理apoE-/-小鼠。

8、探討WS070117和NAC對apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展的作用及其機制。
　　 實驗設計及方法：以高脂飼料喂養(yǎng)30只10周齡雄性apoE-/-小鼠8周，建立動脈粥樣硬化動物模型，同步給與WS070117和NAC藥物干預以觀察對動脈粥樣硬化的影響。以葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度，TBA法測定血脂濃度，病理學染色和免疫組化法分析斑塊內細胞成分及炎癥因子的含量變化，DHE熒光染色法檢測斑塊內ROS的生成，用Westernblot

9、檢測RAGE、p38MAPK、JNK、ERK1/2、NF-κB及其磷酸化水平以及下游的黏附趨化因子MCP-1、VCAM-1和基質金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達水平。
　　 結果：WS070117和NAC對apoE-/-小鼠的血糖和血脂均無明顯的影響，WS070117減少頭臂干斑塊的大小和斑塊內的巨噬細胞量。NAC也減少斑塊內巨噬細胞的含量并顯著增加斑塊內膠原成分含量，但是對斑塊大小無明顯的影響。Westemblot的結果

10、顯示，WS070117和NAC均抑制NF-κB活性相關蛋白和RAGE的表達及ERK1/2、p38MAPK、JNK的磷酸化水平，也降低VCAM-1、MCP-1、MMP-2和MMP-9的表達水平。
　　 結論：我們的結果表明，WS070117和NAC可通過抑制NF-κB活性和RAGE及其相關信號通路蛋白的表達或激活以抑制多種黏附、趨化因子或MMPs的表達，從而抑制動脈粥樣硬化的進展。
　　 第二部分：
　　 Gale

11、ctin-3配體特異性競爭抑制劑——改良的柑橘果膠抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展
　　 目的：我們給予apoE-/-小鼠Galectin-3特異性抑制劑--改良的柑橘果膠(modifiedcitruspectin，MCP)處理，觀察頭臂干部位動脈粥樣硬化斑塊的變化，探討Galectin-3在動脈粥樣硬化起始中的作用以及MCP對動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的影響。
　　 實驗設計及方法：以高脂飼料喂養(yǎng)12只8周齡雄性apoE-/-

12、小鼠，分別口服1％MCP飲用水8周或10%MCP灌胃4周，以觀察其對動脈粥樣硬化進展的影響。以葡萄糖氧化酶法測定血糖濃度，TBA法測定血脂濃度，病理學染色和免疫組化法分析斑塊大小及其內容物的變化。
　　 結果：形態(tài)學觀察的結果顯示，MCP干預后apoE-/-小鼠頭臂干部位的動脈粥樣硬化斑塊大小和斑塊內巨噬細胞的數(shù)量均降低。
　　 結論：我們的結果表明，在動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展過程中，Galectin-3可能參與了內皮細胞