腫瘤壞死因子α在apoE基因缺失小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用研究.pdf

1、動脈粥樣硬化( atherosclerosis，AS)是由多種因素和作用環(huán)節(jié)介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性病理過程，其受多種遺傳因素和外界因素的影響，是H前威脅人類生命的主要疾病之一，是導(dǎo)致冠心病、心肌梗塞等心血管病的主要病理生理基礎(chǔ)。炎癥和血脂異常是AS發(fā)生的主要動因。炎癥反應(yīng)過程貫穿于AS發(fā)生發(fā)展的各個階段，在內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞浸潤、泡沫細(xì)胞形成、平滑肌細(xì)胞遷移增殖到脂質(zhì)條紋、纖維斑塊乃至復(fù)合病變形成的過程中都有炎癥因素參與，AS是慢性局部炎

2、癥的觀點(diǎn)已被廣泛認(rèn)可。目前對AS的甲。其發(fā)病機(jī)制還不明確，往往足血脂代謝紊亂、炎癥以及糖代謝失衡等多種危險因素并存，共同影響著AS的發(fā)生發(fā)展。
　　 TNF-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是生物體內(nèi)主要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，參與機(jī)體的急、慢性炎癥過程。在人類和小鼠的AS病變部位均可檢測到TNF-α的存在。TNF-α促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞的活

3、化與遷移，通過誘導(dǎo)其分泌細(xì)胞因子等方式，發(fā)動炎癥反應(yīng)。但關(guān)于TNF-α在AS中，尤其是脂質(zhì)條紋期的具體作用尚未被完全認(rèn)識。作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，TNF-α在AS發(fā)生過程中對其它炎癥因子和細(xì)胞因子的表達(dá)具有什么影響？它在AS不同階段中的作用是否一致？除炎癥反應(yīng)外，TNF-α是否還存在其它途徑參與AS發(fā)生發(fā)展過程？
　　 ApoE基因缺失（apoE deficient，apoE-/-）小鼠在普通標(biāo)準(zhǔn)飲食條件下能夠自發(fā)產(chǎn)生AS病變，且

4、發(fā)病過程與人類AS極為相似，是研究人類AS的理想模型，為研究人類AS的發(fā)病機(jī)理以及干預(yù)治療提供了極大的方便。本實(shí)驗(yàn)利用apoE-/-/TNF-α-/-(AT)雙基因突變小鼠和apoE基因缺失（apoliprotein E deficient，apoE-/-）小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，利用血生化分析、Real-time RT-PCR、細(xì)胞因子抗體芯片等檢測技術(shù)，結(jié)合冷凍切片、常規(guī)病理染色等形態(tài)學(xué)分析方法，對不同年齡條件下AT和apoE-/-小鼠的血

5、脂水平、主動脈AS病變進(jìn)行了觀察測定，同時對小鼠脾臟和主動脈中炎癥相關(guān)基因，肝臟中膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析，并測定了6周齡小鼠主動脈中64種細(xì)胞因子的含量，旨在明確AS發(fā)生早期，TNF-a對apoE-/-小鼠炎癥因子等細(xì)胞因子表達(dá)的影響作用，同時進(jìn)一步確定TNF-α在AS過程中可能的作用途徑與作用特點(diǎn)。
　　 實(shí)驗(yàn)主要結(jié)果如下：
　　 1.小鼠主動脈根部病理形態(tài)觀察和病變面積分析：
　　 病理形態(tài)

6、觀察結(jié)果表明，apoE-/-小鼠主動脈根部內(nèi)膜白4周齡起開始出現(xiàn)輕度的內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，蘇丹IV染色陽性區(qū)面積和斑塊厚度隨年齡增長逐漸加重。大部分AT小鼠4周齡時，主動脈根部鏡檢時未發(fā)現(xiàn)明顯脂質(zhì)沉積，至6周齡開始出現(xiàn)脂質(zhì)沉積，但病變而積和病變程度要輕于同年齡段的apoE-/-小鼠。至8周齡時，apoE-/-和AT小鼠小鼠主動脈內(nèi)膜處均出現(xiàn)顯著脂質(zhì)沉積，并伴有泡沫細(xì)胞聚集。隨小鼠年齡增大，主動脈根部斑塊分布區(qū)域增多，平均面積進(jìn)一步增大。16周

7、齡小鼠主動脈壁一側(cè)部分區(qū)域蘇丹IV著色不均，表明平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，遷移進(jìn)入病灶部位并吞噬脂質(zhì)形成平滑肌來源的泡沫細(xì)胞。至24周齡時，平滑肌細(xì)胞增殖遷移、吞噬脂質(zhì)程度和病變面積進(jìn)一步加重，管腔變小，血管壁變薄。病變面積分析結(jié)果表明，TNF-a促AS的作用在AS發(fā)生早期的作用更為顯著。4周齡時，apoE-/-小鼠主動脈瓣膜處甲均病變面積是AT小鼠的7.81倍，6周齡時，是AT小鼠的2.58倍。隨著小鼠年齡增加，TNF-α的作用有所減弱

8、，至24周齡時，apoE-/-小鼠主動脈根部的病變面積只比AT小鼠增加了29％。
　　 2.小鼠血脂生化指標(biāo)檢測：
　　 與野生型(wild type，WT)小鼠相比，apoE-/-小鼠在各個年齡階段均表現(xiàn)較為明顯的脂質(zhì)水平的升高。除4周齡和6周齡甘油三酯( triglyceride，TG)外，其余檢測指標(biāo)與WT相比均有顯著性差異（P<0.05）。各年齡段TNF-α-/-小鼠的各項(xiàng)血脂水平與WT相比均不具有顯著性差異。與

9、apoE-/-小鼠相比，AT小鼠的血脂水平呈現(xiàn)如下變化：AT小鼠各年齡段總膽固醇(total cholesterol，TC)水平均低于同年齡的apoE-/-小鼠；AT小鼠各年齡段TG水平也均低于apoE-/-小鼠，但自16周起才具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；apoE-/-小鼠和AT小鼠的血漿低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平在各年齡段均未表現(xiàn)出顯著性差異；4-1

10、2周齡時，血漿高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平apoE-/-小鼠要高于AT小鼠，但24周齡時，AT小鼠血漿HDL-C水平已較apoE-/-小鼠有所提高。以上結(jié)果表明，TNF-α參與了apoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝過程，當(dāng)TNF-α基因缺失后，影響了apoE-/-小鼠的脂質(zhì)代謝，而且這種影響可能是通過HDL的相關(guān)途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.TNF-a缺失前后apo

11、E-/-小鼠脾臟中炎癥基因轉(zhuǎn)錄變化特征：
　　 Real-time RT-PCR結(jié)果表明，TNF-a缺失之后，各個年齡段脾臟中炎癥因子的表達(dá)均受到較大影響。與apoE-/-小鼠相比，6周齡時，所檢測的6種主要細(xì)胞因子的表達(dá)均有所下降，其中白細(xì)胞介素( interleukin，11)10和IL-12 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05)，IL-1β和IL-4 mRNA表達(dá)水平下調(diào)極顯著（P<0.01）。12劇齡時，所檢測的細(xì)胞

12、因子在apoE-/-小鼠和AT小鼠中的表達(dá)情況表達(dá)與6周時出現(xiàn)較大差異.與apoE-/-小鼠相比，有4種細(xì)胞因子mRNA表達(dá)發(fā)生了顯著變化：干擾素(interferon，IFN)γ和IL-1β出現(xiàn)了顯著上調(diào)(P<0.05)，而IL-6和IL-10仍表現(xiàn)出顯著下降的趨勢(P<0.05)，而IL-4和IL-12mRNA表達(dá)水平發(fā)生輕微上調(diào)。24周齡時，所檢測的各細(xì)胞因子的表達(dá)趨勢與12周齡時相似，AT小鼠中IFN-γ、IL-1β、IL-4和

13、IL-12的mRNA表達(dá)水平比apoE-/-小鼠有所上升，而IL-6和IL-10的表達(dá)水平較apoE-/-小鼠低，但是IL-1β、IL-4、IL-10和IL-12的差異不顯著。這表明，TNF-α的缺失對于小鼠脾臟組織中炎癥因子的表達(dá)具有影響作用，且這種影響作用呈現(xiàn)年齡依賴的特點(diǎn)。
　　 4.TNF-α缺失前后6周齡apoE-/-小鼠主動脈炎癥等細(xì)胞因子表達(dá)變化特征：
　　 5.TNF-α缺失前后apoE-/-小鼠肝臟中膽

14、固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)變化特征：
　　 TNF-α可顯著影響apoE-/-小鼠肝臟組織中膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)( reverse cholesterol transport，RCT)相關(guān)的基因表達(dá)，且這種影響在不同年齡階段顯現(xiàn)出不同的作用趨勢。6周時，與apoE-/-小鼠相比，所檢測的六種基因的mRNA表達(dá)水平在AT小鼠中均發(fā)生下降，其中載脂蛋白A-I( apolipoprotein A-I，apo A-I)、肝X受體α(liverX r

15、eceptor alpha.LXRa)、三磷酸腺苷結(jié)合盒A1（ATP binding cassette transporter A1,ABCA1）和β-羥基β-甲基戊二酰輔酶A還原酶（β-hydroxy-β-methyl glutaryl CoA reductase，HMG-CoAR）的表達(dá)顯著下調(diào)。AT小鼠中apoA-I、卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterol acyltrasferase，LCAT)和B類清

16、道大受體I(scavenger receptor class B type I，SR-BI)的表達(dá)量自12周齡起表達(dá)量較apoE-/-小鼠有所上調(diào)，至24周齡時、其表達(dá)量已較apoE-/-小鼠顯著上調(diào)(P0<0.01)。 LXRα和ABCA1表現(xiàn)出類似的表達(dá)特征。12周齡時，AT小鼠的表達(dá)量低于apoE-/-小鼠，但至24周齡時，AT小鼠中的表達(dá)量也呈現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢（P<0.01）。在檢測的三個年齡段中，HMG-CoAR在AT小鼠中