甘草部黃酮干預(yù)ApoE基因敲除小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的研究.pdf

1、目的:
　　建立C57BL/6J小鼠高脂血癥(Hyperlipidemia，HLD)模型，給予甘草總黃酮(Totallicorice flavonoids，TLF)干預(yù)，以銀杏葉片、辛伐他汀作為陽(yáng)性對(duì)照藥，評(píng)價(jià)TLF的調(diào)脂效果;建立ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)模型，給予TLF干預(yù)，以銀杏葉片作為陽(yáng)性對(duì)照藥，分別檢測(cè)血脂水平、抗氧化活力及CRP、IL-6、PLTP等細(xì)胞因

2、子水平等指標(biāo)，光鏡下觀察肝臟和主動(dòng)脈組織病理結(jié)構(gòu)改變，評(píng)價(jià)其對(duì)AS的干預(yù)作用，旨在探討TLF改善AS病理形態(tài)變化的作用及其抗AS可能的作用機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化治療尋找新靶點(diǎn)、為新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.清潔級(jí)C57BL/6J小鼠56只，雄性，體重18-22g，隨機(jī)分為7組，正常組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組（辛伐他汀、銀杏葉片），TLF(30 mg·kg-1，60 mg·kg-1，120 mg·kg-1)

3、3個(gè)劑量組，每組8只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。正常組給予小鼠正常顆粒飼料，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)。正常對(duì)照組、模型組每天灌胃給以等容量生理鹽水，其余各組進(jìn)行給藥干預(yù)，連續(xù)6周。
　　實(shí)驗(yàn)前，禁食不禁水12h，實(shí)驗(yàn)時(shí)摘眼球取血，分離血清，酶法及黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)血清脂質(zhì)水平及抗氧化活力指標(biāo)。
　　2.11周齡ApoE-/-小鼠40只，.雄性、體重22-23g，隨機(jī)分為:模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（銀杏葉片）、TLF(30 mg·kg-1，6

4、0 mg·kg-1，120 mg·kg-1)3個(gè)劑量組，每組8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。另取正常11周齡C57BL/6J小鼠8只為正常對(duì)照組。正常組給予小鼠正常顆粒飼料，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)。正常對(duì)照組、模型組每天灌胃給以等容量生理鹽水，其余各組進(jìn)行給藥干預(yù)，連續(xù)14周。
　　實(shí)驗(yàn)前，禁食不禁水12h，實(shí)驗(yàn)時(shí)摘眼球取血，分離血清，試劑盒檢測(cè)血清脂質(zhì)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)水平，生化法試劑盒檢測(cè)血清抗氧化活力水平(SOD

5、、MDA、ox-LDL)，ELISA法檢測(cè)CRP、IL-6及血清PLTP等相關(guān)細(xì)胞因子水平;分離小鼠主動(dòng)脈及肝臟，進(jìn)行肉眼觀察主動(dòng)脈脂質(zhì)浸潤(rùn)及斑塊形成情況，肝臟色澤、質(zhì)地等改變，制作組織切片，H&E染色，光鏡下觀察主動(dòng)脈內(nèi)膜、平滑肌層脂質(zhì)浸潤(rùn)以及主動(dòng)脈斑塊的病理形態(tài)學(xué)改變及肝細(xì)胞脂肪浸潤(rùn)等病理改變。
　　結(jié)果:
　　1.1高脂血癥模型組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平均明顯升高，與正常組比較均有顯著性差異(P＜0.

6、01)，顯示高血脂癥狀。
　　TLF高劑量組能顯著降低TC、TG、LDL-C水平，與模型組比較，差異顯著(TC、TG--P＜0.05，LDL-C--P＜0.01)，但其對(duì)HDL-C的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TLF中劑量組只能顯著降低LDL-C水平，與模型組比較，差異顯著(P＜0.01)，對(duì)其他血脂指標(biāo)的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TLF低劑量組相比模型組脂質(zhì)指標(biāo)的改變均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1.2模型組顯示SOD水平降低、MDA水平升高，

7、與正常組比較均有顯著性差異（P＜0.01）。TLF低、中、高三種劑量組均能顯著升高SOD水平，與模型組比較，均有顯著性差異(P＜0.01)。TLF高劑量組能夠顯著降低MDA水平，與模型組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。TLF中、低劑量組對(duì)于MDA水平改變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.1 AS模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C顯著下降，與正常組比較均有顯著性差異(P＜0.01)，顯示造模成功。TLF高、中、低

8、劑量組均可有效下調(diào)血清TC、TG水平，與模型組比較，均有有顯著性差異(P＜0.01)。僅TLF高劑量組可有效下調(diào)LDL-C水平，與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.01); TLF中、低劑量組對(duì)LDL-C水平無(wú)顯著影響。TLF高、中劑量組相比模型組可有效上調(diào)HDL-C水平，均有顯著性差異(P＜0.01); TLF低劑量組對(duì)HDL-C水平無(wú)顯著影響。
　　2.2 TLF高、中、低劑量組均能夠升高AS小鼠SOD水平，增強(qiáng)抗氧化活力，下

9、調(diào)ox-LDL水平，表明可抑制LDL的氧化修飾，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　2.3 AS模型組小鼠血清CRP、IL-6、PLTP水平均明顯高于正常組，均有顯著性差異(P＜0.01)。TLF高、中、低3個(gè)劑量組均能降低CRP、IL-6、PLTP水平，與模型組比較，均有顯著性差異(P＜0.01)。
　　2.4正常組鏡下可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)完整、境界清楚，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完整，肝血竇間隙適度、無(wú)充血現(xiàn)象，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

10、。模型組肝小葉境界模糊，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)大量大小不等的脂肪滴，門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維增生。低劑量組肝細(xì)胞脂肪化現(xiàn)象較模型組有所改善，雖有脂肪顆粒，但是主要出現(xiàn)在肝小葉周圍交界處，肝血竇有充血現(xiàn)象，門管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。中劑量組肝細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)少量的脂肪滴，門管區(qū)有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，陽(yáng)性組肝小葉周圍的肝細(xì)胞質(zhì)中幾無(wú)脂肪顆粒，門管區(qū)幾無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照比較，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，未見(jiàn)脂肪樣變，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

11、，病理變化改善情況相似。
　　正常組主動(dòng)脈內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接，內(nèi)膜與中膜均未見(jiàn)泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積。模型組主動(dòng)脈根部可見(jiàn)內(nèi)膜增厚，有斑塊形成，纖維斑塊有完整的纖維帽，泡沫細(xì)胞堆積、部分破裂，膠原及彈力纖維沉積。低劑量組主動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)中度脂質(zhì)變性、增厚;管周有程度不等的脂質(zhì)沉積，部分有斑塊形成，內(nèi)皮下可見(jiàn)泡沫細(xì)胞沉積，有少量膠原及彈力纖維沉積，呈中度病變。中劑量組內(nèi)膜有輕度脂質(zhì)變性;內(nèi)皮偶見(jiàn)泡沫細(xì)胞，少見(jiàn)脂質(zhì)沉積，部分泡沫細(xì)胞。高劑

12、量組偶見(jiàn)內(nèi)膜輕度增厚，內(nèi)皮下偶見(jiàn)泡沫細(xì)胞，管周無(wú)明顯脂質(zhì)沉積病變。陽(yáng)性組內(nèi)膜輕度增厚，內(nèi)皮下可見(jiàn)少量泡沫細(xì)胞，膠原纖維沉積較模型組顯著減輕，高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照比較，病理變化改善情況較好。
　　結(jié)論:
　　1.TLF能夠降低C57BL/6J小鼠高脂血脂模型血清TC、TG、LDL-C水平，具有較好的調(diào)節(jié)血脂作用;可提高模型的SOD水平，抑制MDA生成，增強(qiáng)抗氧化活力。
　　2.TLF3種劑量均可不同程度調(diào)節(jié)ApoE-/-小