胱硫醚γ-裂解酶-硫化氫在脂多糖誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:探討脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞胱硫醚γ-裂解酶-硫化氫(cystathionineγ-lysae-hydrogen sulfide，CSE-H2S)體系的規(guī)律性變化;查明CSE來源的H2S在LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用，探討內(nèi)源性H2S參與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法:大鼠肝細(xì)胞系BRL細(xì)胞培養(yǎng)，用CSE siRNA應(yīng)用于正常培養(yǎng)的BRL細(xì)胞、LPS處理的BRL細(xì)胞。用RT

2、-PCR、Western blot檢測CSE的基因和蛋白表達(dá)變化，用去蛋白法檢測細(xì)胞內(nèi)源性H2S生成量變化;生化方法檢測細(xì)胞上清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性、細(xì)胞丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、細(xì)胞還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量以及MTT細(xì)胞生長抑制率變化;用流式細(xì)胞術(shù)、Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率變化;熒光顯微鏡檢測線粒體膜電位(

3、mitochondrialmembrane potential，MMP)變化;Western blot檢測細(xì)胞色素C(CytochromeC，Cyt C)、caspase-3激活體蛋白(cleaved Caspase-3)表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:1、大鼠肝細(xì)胞系BRL細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下存在著CSE基因、蛋白表達(dá)以及內(nèi)源性H2S生成;CSE siRNA引起B(yǎng)RL細(xì)胞CSE蛋白表達(dá)下調(diào)，內(nèi)源性H2S生成明顯減少;與Negative

4、 control組比較，CSEsiRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞4-24h，BRL細(xì)胞上清LDH活性、細(xì)胞MDA含量、細(xì)胞GSH含量、MTT細(xì)胞增殖活力及細(xì)胞凋亡率均無明顯影響。2、隨著LPS作用時(shí)間延長(0～24h)及LPS作用濃度(0.1～100μg/ml)升高，CSE基因、蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，內(nèi)源性H2S生成呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性明顯增多;細(xì)胞凋亡比率上升，細(xì)胞MMP降低，胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達(dá)上調(diào);BRL細(xì)胞上清

5、LDH活性增加，細(xì)胞MDA含量上升，細(xì)胞GSH含量在8h上調(diào)，12h、24h下降，MTT細(xì)胞生長抑制率在8h下調(diào)，12h、24h上升。3、CSE siRNA與LPS共同作用BRL細(xì)胞，與LPS單獨(dú)作用組相比，BRL細(xì)胞凋亡率在4h上升，8h無顯著性差異，12h、24h明顯下降;細(xì)胞MMP在4h下降，8h無顯著性差異，12h、24h明顯上升;胞漿Cyt C、caspase-3激活體蛋白表達(dá)在4h上升，8h無顯著性差異，12h、24h明顯下