胱硫醚-γ-裂解酶-硫化氫體系在八肽膽囊收縮素減輕脂多糖所致的急性肺損傷中的作用及機(jī)制初探.pdf

1、急性肺損傷(acute lunginjury,ALI)可由多種原因引起，主要病理特征為肺泡毛細(xì)血管膜和肺泡上皮廣泛受損而致的肺水腫和肺不張，臨床上可表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥，進(jìn)一步發(fā)展至呼吸衰竭即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。多種病因(包括肺內(nèi)/月市外，感染/非感染)都能直接或間接地引起 ALI及ARDS。革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性成分脂多糖(1ipo

2、polysaccharide，LPS)是導(dǎo)致肺部感染和全身感染的主要因素。LPS由其受體介導(dǎo)啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，在肺部可表現(xiàn)為ALI。然而對(duì)于LPS啟動(dòng)機(jī)體炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致ALI的具體機(jī)制尚未完全闡明。 膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種典型的腦腸肽，它不但具有胃腸激素的功能，還以神經(jīng)遞質(zhì)

3、和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的形式發(fā)揮著重要的生理和病理生理作用。八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)為內(nèi)源性CCK的重要功能片段。以往對(duì)CCK的研究多偏重于其在消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等的調(diào)節(jié)作用。CCK-8 在肺臟也有分布。本室一直致力于研究CCK-8的抗內(nèi)毒素休克(endotoxinshock，ES)及抗炎作用。CCK的作用主要由兩種受體介導(dǎo)，即CCK-A受體(CCK-A receptor,CC

4、K-AR)和CCK-B受體(CCK-B receptor,CCK-BR)。但有關(guān)CCK-8的抗炎作用及其機(jī)制尚未完全闡明，仍存在許多問題亟待解決。 內(nèi)源性氣體信號(hào)分子是一類具有多種生理和病理生理作用的生物物質(zhì)，它們的發(fā)現(xiàn)為 ALI發(fā)病機(jī)制的研究開辟了一個(gè)新的領(lǐng)域。迄今已證實(shí)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子有三種，即一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳(carbon．monoxide，CO)和硫化氫(hydrogen sulf

5、ide，H<,2>S)。NO和CO在ALI中的作用已得到了證實(shí)。H<,2>S是繼NO和CO之后被確認(rèn)的第三種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子。它是由含硫氨基酸被磷酸吡多醛-5’-磷酸依賴性酶[包括胱硫醚-β-合酶(cystathionine β-synthase，CB S)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)]等催化產(chǎn)生的。關(guān)于生理和病理情況下H<,2>S作用的研究雖剛剛起步，但己證實(shí)H<,2>S參與了神經(jīng)和血管

6、等的生理功能調(diào)節(jié)，以及高血壓、肺動(dòng)脈高壓、內(nèi)毒素休克等疾病的發(fā)生。那么，探明H2S在LPS所致ALI中發(fā)揮何種作用，是本研究的主要目的之一。研究表明，肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(lung microvascular endothelial cells,LMVEC)的活化和損傷在LPS所致的ALI中發(fā)揮重要作用。LPS介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活化的信號(hào)通路錯(cuò)綜復(fù)雜，但目前認(rèn)為L(zhǎng)PS—CD14-TLR4-IRAK-IKK—IkB-NF-NF-kB-proinfl

7、ammatory cytokines 是其中一條關(guān)鍵的信號(hào)通路，即LPS與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面LPS受體CD14結(jié)合后，激活Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)并與之結(jié)合形成受體復(fù)合物，募集適配分子MyD88，MyD88的死亡結(jié)構(gòu)域再募集下游的IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor-associated kinase,IRAK)到受體復(fù)合物。IRAK隨后發(fā)生自磷酸化，從受體復(fù)合物解離，募集TNF受體

8、相關(guān)因子6(TNF receptor-associatedfactor 6，TRAF6)，順次激活下游激酶，包括NF-kB誘導(dǎo)激酶(NF-kB-inducing kinase，NIK)和絲裂素活化蛋白激酶/ERK激酶激酶(mitogen-activated proteinkinase/ERK kinase kinase 1，MEKK1)。激活的NIK或MEKK1 都能獨(dú)自激活I(lǐng)KK復(fù)合物，導(dǎo)致IkB磷酸化降解，NF-kB移位入核，啟動(dòng)目

9、的基因轉(zhuǎn)錄。 CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織中CSE表達(dá)有何作用，它是否通過調(diào)控CSE/H<,2>S來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，以及TLR4/NF-kB通路是否參與CCK-8對(duì)LPS誘導(dǎo)的CSE表達(dá)的調(diào)控均未見報(bào)道。本研究在我室以往系列研究的基礎(chǔ)上，從整體、細(xì)胞及分子水平，觀察CCK-8對(duì)LPS所致的ALI及LMVEC損傷的改善作用，CCK受體(CCKreceptor,CCK-R)在LMVEC中的分布及表達(dá)變化，以及CCK-8對(duì)LP

10、S誘導(dǎo)的CSE/H<,2>S的影響及TLR4/NF-kB通路在此過程中的作用，以探討CSE/H<,2>S體系在CCK-8抗LPS所致的ALI中的作用，為臨床防治ALI提供新的對(duì)策。 1 內(nèi)、外源性H<,2>S在CCK-8減輕脂多糖所致急性肺損傷中的作用 本部分實(shí)驗(yàn)的目的是觀察內(nèi)、外源性H<,2>S在CCK-8抗LPS所致的ALI中的作用。將84只雄性SD大鼠隨機(jī)分為7組(每組12只)：①對(duì)照組：氣管內(nèi)滴注無熱原生理鹽水(

11、200μl·只<'-1>)；②LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS(200μg·200μl<'-1>·只<'-1>)；③NaHS+LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS前10 min經(jīng)腹腔注射0.5 mL NariS(28μmol·kg<'-1>)；④PPG+LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS前10 min經(jīng)腹腔注射0.5 mL PPG(45μmol·kg<'-1>)；⑤CCK-8+LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS前10 min經(jīng)舌靜脈注射CCK-8(40μg·kg<'-

12、1>)；⑥PPG+CCK-8+LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS前10 min先腹腔注射PPG(劑量同前)，隨即舌靜脈注射CCK-8 (劑量同前)；⑦CCK-8組：氣管內(nèi)滴注生理鹽水前1 0 min經(jīng)舌靜脈注射CCK-8 (劑量同前)。于給藥后4 h、8 h觀察。留取血漿以檢測(cè)H<,2>S含量。制備支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)以檢測(cè)其中中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear ne

13、utrophils，PMN)數(shù)目和蛋白含量。未進(jìn)行支氣管肺泡灌洗的動(dòng)物的動(dòng)物摘取全肺稱重并測(cè)定肺系數(shù)，留取左肺葉中上部，用于制備肺組織勻漿以測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性和P-選擇素(P-selectin，P-SLT)水平。10％中性甲醛固定左肺葉下部，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)HE染色以觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變并進(jìn)行定量評(píng)價(jià)指標(biāo)(index ofquanti

14、tative assessment，IQA)的測(cè)定。 2 CSE/H<,2>S體系在CCK-8 減輕脂多糖所致的急性肺損傷中的作用機(jī)制 3 CSE/H<,2>S體系在CCK-8 減輕脂多糖所致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用及其機(jī)制 本實(shí)驗(yàn)旨在通過培養(yǎng)大鼠LMVEC，觀察H<,2>S在CCK-8減輕LPS所致LMVEC損傷中的作用及其機(jī)制以及CCK-R在LMVEC中的分布和表達(dá)的變化。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)從

15、整體、細(xì)胞和分子水平較為系統(tǒng)地觀察了CSE/H<,2>S 體系在CCK-8減輕LPS所致 ALI和LMVEC損傷中的作用，并探討了在此過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和受體機(jī)制，為其在臨床上應(yīng)用提供了新的、可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 1 氣管內(nèi)滴注LPS可引起明顯的肺組織損傷，同時(shí)血漿H<,2>S含量下降；抑制內(nèi)源性H<,2>S的產(chǎn)生，可加重LPS所致的 ALI，提示H<,2>S具有抗肺損傷作用，其機(jī)制可能與其抑制肺內(nèi)PMN聚集及由此引起的炎癥反

16、應(yīng)和氧化損傷有關(guān)。CCK-8可減輕肺損傷的同時(shí)上調(diào)血漿H<,2>S含量。CCK-8細(xì)胞保護(hù)作用的發(fā)揮與內(nèi)源性H<,2>S生成之間可能具有某種內(nèi)在聯(lián)系。 2 CCK-8通過上調(diào)CSEmRNA表達(dá)和CSE蛋白活性增加而發(fā)揮肺保護(hù)作用。并在整體和細(xì)胞水平證實(shí)CCK-8上調(diào)CSE表達(dá)可能是通過NF-kB 信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控的。在這一過程中，NF-kB對(duì)TLR4 可能存在重要的的調(diào)節(jié)作用。H<,2>S可上調(diào)ALI大鼠肺組織CCKA/B R的

17、表達(dá)。 3 在培養(yǎng)的LMVEC水平，CCK-8也可減輕LPS的損傷作用，此作用可能由CCK-R介導(dǎo)，通過上調(diào)LPS所致大鼠LMVEC CSEmRNA表達(dá)實(shí)現(xiàn)的；同時(shí)提示LMVEC在CCK-8減輕LPS所致ALI中發(fā)揮重要作用。 4 首次發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的LMVEC上存在CCK-BR。LPS作用下，CCK-BRmRNA表達(dá)上調(diào)，是內(nèi)源和外源性CCK-8 發(fā)揮其改善LPS損傷作用和調(diào)控CSE/H<,2>S體系的重要受體機(jī)制。