胱硫醚-γ-裂解酶-硫化氫體系在八肽膽囊收縮素減輕脂多糖所致的急性肺損傷中的作用及機制初探.pdf

1、急性肺損傷(acute lunginjury,ALI)可由多種原因引起，主要病理特征為肺泡毛細血管膜和肺泡上皮廣泛受損而致的肺水腫和肺不張，臨床上可表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥，進一步發(fā)展至呼吸衰竭即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。多種病因(包括肺內/月市外，感染/非感染)都能直接或間接地引起 ALI及ARDS。革蘭氏陰性細菌內毒素的主要活性成分脂多糖(1ipo

2、polysaccharide，LPS)是導致肺部感染和全身感染的主要因素。LPS由其受體介導啟動機體炎癥反應，進而導致全身性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，在肺部可表現(xiàn)為ALI。然而對于LPS啟動機體炎癥反應、導致ALI的具體機制尚未完全闡明。 膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)是一種典型的腦腸肽，它不但具有胃腸激素的功能，還以神經遞質

3、和神經調質的形式發(fā)揮著重要的生理和病理生理作用。八肽膽囊收縮素(cholecystokinin octapeptide，CCK-8)為內源性CCK的重要功能片段。以往對CCK的研究多偏重于其在消化系統(tǒng)、神經系統(tǒng)及內分泌系統(tǒng)等的調節(jié)作用。CCK-8 在肺臟也有分布。本室一直致力于研究CCK-8的抗內毒素休克(endotoxinshock，ES)及抗炎作用。CCK的作用主要由兩種受體介導，即CCK-A受體(CCK-A receptor,CC

4、K-AR)和CCK-B受體(CCK-B receptor,CCK-BR)。但有關CCK-8的抗炎作用及其機制尚未完全闡明，仍存在許多問題亟待解決。 內源性氣體信號分子是一類具有多種生理和病理生理作用的生物物質，它們的發(fā)現(xiàn)為 ALI發(fā)病機制的研究開辟了一個新的領域。迄今已證實的內源性氣體信號分子有三種，即一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳(carbon．monoxide，CO)和硫化氫(hydrogen sulf

5、ide，H<,2>S)。NO和CO在ALI中的作用已得到了證實。H<,2>S是繼NO和CO之后被確認的第三種內源性氣體信號分子。它是由含硫氨基酸被磷酸吡多醛-5’-磷酸依賴性酶[包括胱硫醚-β-合酶(cystathionine β-synthase，CB S)、胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)]等催化產生的。關于生理和病理情況下H<,2>S作用的研究雖剛剛起步，但己證實H<,2>S參與了神經和血管

6、等的生理功能調節(jié)，以及高血壓、肺動脈高壓、內毒素休克等疾病的發(fā)生。那么，探明H2S在LPS所致ALI中發(fā)揮何種作用，是本研究的主要目的之一。研究表明，肺微血管內皮細胞(lung microvascular endothelial cells,LMVEC)的活化和損傷在LPS所致的ALI中發(fā)揮重要作用。LPS介導內皮細胞活化的信號通路錯綜復雜，但目前認為LPS—CD14-TLR4-IRAK-IKK—IkB-NF-NF-kB-proinfl

7、ammatory cytokines 是其中一條關鍵的信號通路，即LPS與內皮細胞膜表面LPS受體CD14結合后，激活Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)并與之結合形成受體復合物，募集適配分子MyD88，MyD88的死亡結構域再募集下游的IL-1受體相關激酶(IL-1 receptor-associated kinase,IRAK)到受體復合物。IRAK隨后發(fā)生自磷酸化，從受體復合物解離，募集TNF受體

8、相關因子6(TNF receptor-associatedfactor 6，TRAF6)，順次激活下游激酶，包括NF-kB誘導激酶(NF-kB-inducing kinase，NIK)和絲裂素活化蛋白激酶/ERK激酶激酶(mitogen-activated proteinkinase/ERK kinase kinase 1，MEKK1)。激活的NIK或MEKK1 都能獨自激活IKK復合物，導致IkB磷酸化降解，NF-kB移位入核，啟動目

9、的基因轉錄。 CCK-8對LPS誘導的大鼠肺組織中CSE表達有何作用，它是否通過調控CSE/H<,2>S來發(fā)揮細胞保護作用，以及TLR4/NF-kB通路是否參與CCK-8對LPS誘導的CSE表達的調控均未見報道。本研究在我室以往系列研究的基礎上，從整體、細胞及分子水平，觀察CCK-8對LPS所致的ALI及LMVEC損傷的改善作用，CCK受體(CCKreceptor,CCK-R)在LMVEC中的分布及表達變化，以及CCK-8對LP

10、S誘導的CSE/H<,2>S的影響及TLR4/NF-kB通路在此過程中的作用，以探討CSE/H<,2>S體系在CCK-8抗LPS所致的ALI中的作用，為臨床防治ALI提供新的對策。 1 內、外源性H<,2>S在CCK-8減輕脂多糖所致急性肺損傷中的作用 本部分實驗的目的是觀察內、外源性H<,2>S在CCK-8抗LPS所致的ALI中的作用。將84只雄性SD大鼠隨機分為7組(每組12只)：①對照組：氣管內滴注無熱原生理鹽水(

11、200μl·只<'-1>)；②LPS組：氣管內滴注LPS(200μg·200μl<'-1>·只<'-1>)；③NaHS+LPS組：氣管內滴注LPS前10 min經腹腔注射0.5 mL NariS(28μmol·kg<'-1>)；④PPG+LPS組：氣管內滴注LPS前10 min經腹腔注射0.5 mL PPG(45μmol·kg<'-1>)；⑤CCK-8+LPS組：氣管內滴注LPS前10 min經舌靜脈注射CCK-8(40μg·kg<'-

12、1>)；⑥PPG+CCK-8+LPS組：氣管內滴注LPS前10 min先腹腔注射PPG(劑量同前)，隨即舌靜脈注射CCK-8 (劑量同前)；⑦CCK-8組：氣管內滴注生理鹽水前1 0 min經舌靜脈注射CCK-8 (劑量同前)。于給藥后4 h、8 h觀察。留取血漿以檢測H<,2>S含量。制備支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)以檢測其中中性粒細胞(polymorphonuclear ne

13、utrophils，PMN)數(shù)目和蛋白含量。未進行支氣管肺泡灌洗的動物的動物摘取全肺稱重并測定肺系數(shù)，留取左肺葉中上部，用于制備肺組織勻漿以測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活性和P-選擇素(P-selectin，P-SLT)水平。10％中性甲醛固定左肺葉下部，常規(guī)石蠟包埋、切片，經HE染色以觀察肺組織形態(tài)學改變并進行定量評價指標(index ofquanti

14、tative assessment，IQA)的測定。 2 CSE/H<,2>S體系在CCK-8 減輕脂多糖所致的急性肺損傷中的作用機制 3 CSE/H<,2>S體系在CCK-8 減輕脂多糖所致肺微血管內皮細胞損傷中的作用及其機制 本實驗旨在通過培養(yǎng)大鼠LMVEC，觀察H<,2>S在CCK-8減輕LPS所致LMVEC損傷中的作用及其機制以及CCK-R在LMVEC中的分布和表達的變化。 結論 本實驗從

15、整體、細胞和分子水平較為系統(tǒng)地觀察了CSE/H<,2>S 體系在CCK-8減輕LPS所致 ALI和LMVEC損傷中的作用，并探討了在此過程中的信號轉導機制和受體機制，為其在臨床上應用提供了新的、可靠的動物實驗依據(jù)。 1 氣管內滴注LPS可引起明顯的肺組織損傷，同時血漿H<,2>S含量下降；抑制內源性H<,2>S的產生，可加重LPS所致的 ALI，提示H<,2>S具有抗肺損傷作用，其機制可能與其抑制肺內PMN聚集及由此引起的炎癥反

16、應和氧化損傷有關。CCK-8可減輕肺損傷的同時上調血漿H<,2>S含量。CCK-8細胞保護作用的發(fā)揮與內源性H<,2>S生成之間可能具有某種內在聯(lián)系。 2 CCK-8通過上調CSEmRNA表達和CSE蛋白活性增加而發(fā)揮肺保護作用。并在整體和細胞水平證實CCK-8上調CSE表達可能是通過NF-kB 信號通路進行調控的。在這一過程中，NF-kB對TLR4 可能存在重要的的調節(jié)作用。H<,2>S可上調ALI大鼠肺組織CCKA/B R的

17、表達。 3 在培養(yǎng)的LMVEC水平，CCK-8也可減輕LPS的損傷作用，此作用可能由CCK-R介導，通過上調LPS所致大鼠LMVEC CSEmRNA表達實現(xiàn)的；同時提示LMVEC在CCK-8減輕LPS所致ALI中發(fā)揮重要作用。 4 首次發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的LMVEC上存在CCK-BR。LPS作用下，CCK-BRmRNA表達上調，是內源和外源性CCK-8 發(fā)揮其改善LPS損傷作用和調控CSE/H<,2>S體系的重要受體機制。