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文檔簡(jiǎn)介
1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述:
研究一 非對(duì)稱雙鏈小干擾RNA下調(diào)細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)的抑制前列腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的研究
背景:
前列腺癌是泌尿外科常見(jiàn)的腫瘤,隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)這一疾病的認(rèn)識(shí)不斷深入,針對(duì)前列腺癌的治療手段亦趨于多樣化,但是對(duì)于去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)仍缺乏有效治療手段。近年來(lái),針對(duì)CRPC的基因治療逐漸成為研究熱點(diǎn),而其中尋找到能夠發(fā)揮抗前列腺癌效應(yīng)基因靶點(diǎn)顯得尤為重要。葡萄糖調(diào)節(jié)
2、蛋白78KD(GRP78)是一種在腫瘤細(xì)胞生存和進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的蛋白,近年的研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)多種類型腫瘤細(xì)胞中的GRP78表達(dá)可發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。然而,目前尚缺少通過(guò)下調(diào)GRP78觀察其能否在前列腺癌中發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的研究。此外,近期的部分研究表明非對(duì)稱小干擾RNA(asiRNA)可比傳統(tǒng)的對(duì)稱性小干擾RNA更加有效且持久的下調(diào)靶基因的表達(dá)。因此在本研究中,針對(duì)GRP78的mRNA序列設(shè)計(jì)了一系列的非對(duì)稱小干擾RNA,以觀察其對(duì)前列腺
3、癌細(xì)胞生物學(xué)行為的效應(yīng)。
方法:
通過(guò)RT-PCR和Western Blotting方法評(píng)估了三種不同的前列腺細(xì)胞系中GRP78的表達(dá)水平;針對(duì)GRP78的mRNA序列設(shè)計(jì)并合成了一系列非對(duì)稱小干擾RNA;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選合適的轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染濃度;對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌PC-3細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,觀察非對(duì)稱小干擾RNA下調(diào)細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)的效應(yīng),并與對(duì)稱性小干擾RNA進(jìn)行比較;隨后觀察特異性下調(diào)GRP78對(duì)PC-3細(xì)
4、胞生長(zhǎng)率,凋亡及遷移的影響;通過(guò)檢測(cè)caspase信號(hào)途徑相關(guān)蛋白和細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白探討非對(duì)稱小干擾RNA下調(diào)細(xì)胞內(nèi)GRP78抗前列腺癌效應(yīng)的可能機(jī)制。
結(jié)果:
相對(duì)于傳統(tǒng)的對(duì)稱性小干擾RNA,針對(duì)GRP78mRNA設(shè)計(jì)的15bp非對(duì)稱小干擾RNA(asiGRP78-3)表現(xiàn)出了更強(qiáng)的下調(diào)PC-3細(xì)胞GRP78表達(dá)水平的效應(yīng)。通過(guò)asiGRP78-3下調(diào)GRP78在PC-3中的表達(dá),可抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)率,誘導(dǎo)其凋
5、亡并抑制其遷移能力。進(jìn)一步研究表明,GRP78下調(diào)抑制了PC-3細(xì)胞的AKT磷酸化并下調(diào)pro-caspase9和pro-caspase3表達(dá),可能是asiGRP78-3促進(jìn)PC-3細(xì)胞凋亡的機(jī)制;下調(diào)GRP78的同時(shí)PC-3細(xì)胞中波形蛋白(vimentin)的表達(dá)也下調(diào),這可能是asiGRP78-3抑制PC-3遷移的機(jī)制。
結(jié)論:
相比于對(duì)稱性小分子干擾RNA,非對(duì)稱小干擾RNA可更有效的下調(diào)前列腺癌細(xì)胞內(nèi)GRP7
6、8表達(dá)水平。非對(duì)稱小干擾RNA下調(diào)GRP78表達(dá)后可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡并抑制其遷移,因此GRP78具有作為去勢(shì)抵抗性前列腺癌的基因治療靶點(diǎn)的價(jià)值,而非對(duì)稱小干擾RNA在下調(diào)前列腺癌GRP78表達(dá)方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
研究二 pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達(dá)載體表達(dá)短發(fā)卡RNA上調(diào)細(xì)胞內(nèi)KLF4表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的研究
背景:
前列腺癌已成為
7、泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。雖然目前針對(duì)前列腺癌的治療手段非常多樣,但去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)仍然是前列腺癌的治療難點(diǎn),因此針對(duì)CRPC的基因治療逐漸成為治療熱點(diǎn)。Krüppel樣因子4(KLF4)是細(xì)胞內(nèi)一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,其表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)腫瘤增殖和遷移。近年的研究顯示,小RNA不僅可以下調(diào)細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá),也可以特異性上調(diào)某些基因表達(dá)。與人工合成的雙鏈小RNA相比,通過(guò)質(zhì)粒載體表達(dá)的短發(fā)卡小RNA(shRNA)作用持續(xù)性更
8、佳且可以與靶向分子等材料偶聯(lián)。本研究擬針對(duì)KLF4啟動(dòng)子中特定序列設(shè)計(jì)重組質(zhì)粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達(dá)載體,并將其導(dǎo)入前列腺癌細(xì)胞PC-3中,觀察其上調(diào)KLF4表達(dá)的效應(yīng),并檢測(cè)其對(duì)前列腺癌細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為的影響。
方法:
本研究根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則,針對(duì)KLF4啟動(dòng)子-496序列設(shè)計(jì)并人工合成saKLF4-496激活序列,使用T4 DNA ligase連接酶將合成后的sa
9、KLF4-496連接入重組載體pENTR/CMV-EGFP-U6構(gòu)建重組質(zhì)粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達(dá)載體;重組質(zhì)粒經(jīng)擴(kuò)增、提取后測(cè)序鑒定;使用陽(yáng)離子聚合物將pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞,優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率后,以RT-PCR方法和Western Blotting方法檢測(cè)PC-3細(xì)胞內(nèi)KLF4表達(dá)情況;采用transwell方法,檢測(cè)轉(zhuǎn)染了pENTR/CMV-E
10、GFP-U6-saKLF4-496的PC-3細(xì)胞遷移能力的變化。
結(jié)果:
成功構(gòu)建的針對(duì)KLF4啟動(dòng)子-496序列設(shè)計(jì)的重組質(zhì)粒pENTR/CMV-EGFP-U6-saKLF4-496真核表達(dá)載體;轉(zhuǎn)染此載體后96小時(shí),RT-PCR檢測(cè)到PC-3細(xì)胞內(nèi)KLF4 mRNA表達(dá)上調(diào),轉(zhuǎn)染后96小時(shí)Western Blotting檢測(cè)到PC-3細(xì)胞內(nèi)KLF4蛋白表達(dá)上調(diào);Transwell檢測(cè)表明,轉(zhuǎn)染pENTR/CMV-
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