siRNA沉默類肝素酶基因的表達(dá)對人前列腺癌細(xì)胞惡性生物行為學(xué)的影響.pdf

1、目的：類肝素酶（Heparanase HPSE）是一種能夠在某些限制性的位點(diǎn)裂解硫酸乙酰肝素(heparan sulfate HS)的一種內(nèi)β-D葡萄糖醛酸酶.由于其參與了細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix ECM）和基底膜(basement membrane BM)的降解和重塑,因此被認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤的血管形成等方面起著非常重要的作用。我們利用靶向類肝素酶基因沉默的小干擾RNA（small inte

2、rference RNA siRNA）來探討抑制該基因的表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響、Argonaute蛋白在RNA干擾（RNA interference RNA I）中的作用及HPSE對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9 MMP-9)的調(diào)控關(guān)系。
　　 方法：人前列腺癌細(xì)胞株

3、PC3高表達(dá)類肝素酶基因和Argonaute基因。我們針對人的類肝素酶mRNA序列合成了四對小干擾RNA，針對人的Argonaute mRNA的序列合成了兩對小干擾RNA，利用脂質(zhì)體Lipofectemine2000做為載體將siRNAs轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）來檢測類肝素酶和Argon

4、aute基因被siRNA沉默后mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、克隆形成實驗、細(xì)胞粘附實驗、細(xì)胞Transwell侵襲實驗和血管形成實驗分別檢測對PC3細(xì)胞的增殖、粘附、侵襲和血管生成的影響。
　　 結(jié)果：與空白組相比，轉(zhuǎn)染了靶向HPSE-siRNA的HESP基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降，抑制HPSE基因表達(dá)的作用時間于轉(zhuǎn)染后24~96小時，癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成能力均受到明顯抑制。此外，

5、靶向抑制Argonaute-1（AGO-1）和Argonaute-2（AGO-2）基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)HPSE-siRNA組的HESP基因表達(dá)的抑制，這表明AGO-1和AGO-2參與了siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默的途徑之中。與此同時，我們還在實驗中發(fā)現(xiàn)，在HPSE-siRNA組中，HPSE基因表達(dá)的抑制還可導(dǎo)致與腫瘤密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的明顯下調(diào)。
　　

6、結(jié)論：靶向沉默HESP基因的表達(dá)可顯著抑制人前列腺癌細(xì)胞PC3體外的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的能力。靶向類肝素酶（HPSE）基因沉默的siRNA具有治療前列腺癌的潛在應(yīng)用價值。AGO-1和AGO-2基因參與了siRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默途徑之中,并是RNA干擾(RNA interference RNAi)發(fā)揮有效作用不可或缺的重要組成部分。此外siRNA靶向HPSE基因的沉默將導(dǎo)致VEGF和MMP-P表達(dá)的下調(diào)，這表明HPSE積極參與了對