荔枝轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織原生質(zhì)體高頻率再生.pdf

1、本研究以采用基因槍轉(zhuǎn)化法，將外源htp和gus(uidA)基因轉(zhuǎn)入荔枝(LitchichinensisSoon.)晚熟優(yōu)良品種‘下番枝’，并經(jīng)篩選得到的11個(gè)荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織(Transgenicresistantembryogeniccalli，TREC)細(xì)胞系為材料，進(jìn)行荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織長(zhǎng)期繼代保持系統(tǒng)的優(yōu)化及其gus檢測(cè)；選擇其中的5個(gè)轉(zhuǎn)基因抗性細(xì)胞系(Q811、Q81.535，Q9221、Q9223和Q101

2、6)進(jìn)行原生質(zhì)體分離和高頻率再生培養(yǎng)；采用轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體來(lái)源的愈傷組織進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，并再生轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下： 1.荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織長(zhǎng)期繼代保持系統(tǒng)的優(yōu)化。采用交替培養(yǎng)基培養(yǎng)荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織，繼代2年，轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織仍然保持旺盛生長(zhǎng)而且GUS表達(dá)量穩(wěn)定。適合的交替培養(yǎng)基為附加1.0mg·L-12,4-D的MS培養(yǎng)基和附加1.0mg·L-12,4-D+50mg·L-1潮霉素的MS培養(yǎng)基。

3、 2.荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織的GUS檢測(cè)。荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織長(zhǎng)期繼代保持過程中的GUS組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果是：抗性細(xì)胞系Q811、Q81.535為大量穩(wěn)定表達(dá)GUS類型；Q9221、Q9223為嵌合表達(dá)GUS類型；Q1016、Q6L61、Q6L161、Q42-1、Q42-2、N31、N21則為穩(wěn)定不表達(dá)GUS類型。 3.荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織原生質(zhì)體分離條件的優(yōu)化。荔枝轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織Q811抗性細(xì)胞系原生質(zhì)

4、體分離條件的適宜條件是：轉(zhuǎn)基因抗性胚性愈傷組織培養(yǎng)16-18d后，轉(zhuǎn)入含0.8％纖維素酶CelluloseR-10和0.4％離析酶MacreaseR-10的CPW-13M酶液中，在(25±2)℃，黑暗條件下，連續(xù)振蕩(30-40r·min-1)10-11h進(jìn)行酶解。在最適條件下，荔枝轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到1.82×107個(gè)/g，活力達(dá)97.5％。 4.荔枝轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織原生質(zhì)體高頻率再生體系的建立。以M12(修改的MS附加1

5、.0mg·L-12，4-D+0.2mg·L-1NAA+0.2mg·L-1BA+0.2mg·L-1KT+250mg·L-1谷氨酰胺+50ml·L-1CW(椰乳)+0.45M葡萄糖和0.1M蔗糖)為培養(yǎng)基，培養(yǎng)密度為3.0×105個(gè)/mL，采用海藻酸鹽包埋懸浮方式進(jìn)行暗培養(yǎng)，荔枝轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體的分裂頻率可高達(dá)18.78％，植板率達(dá)22.30％，小克隆形成頻率達(dá)3.24％。 5.荔枝轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體再生愈傷組織的GUS檢測(cè)。轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)

6、體來(lái)源的5個(gè)愈傷組織抗性細(xì)胞系中：抗性細(xì)胞系PQ811、PQ81.535為大量穩(wěn)定表達(dá)GUS類型；PQ9221、PQ9223、PQ1016均為穩(wěn)定不表達(dá)GUS類型。 6.荔枝轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體再生愈傷組織的體胚發(fā)生。轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體來(lái)源的愈傷組織以T1(附加1.0mg·L-12，4-D、2％蔗糖和0.7％瓊脂的MS培養(yǎng)基)、T3(附加0.1mg·L-1NAA、3.5mg·L-1ZT、100mg·L-1肌醇、5％蔗糖和1.0％瓊脂的MS