玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力全基因組遺傳解析及候選基因功能研究.pdf

1、玉米是全世界重要的糧食作物和能源作物，中國雖然是全世界玉米第二大生產(chǎn)國，但是缺乏抗逆、抗病、高配合力和適應(yīng)性廣的優(yōu)質(zhì)玉米種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因育種是改良玉米種質(zhì)資源的重要途徑之一。玉米幼胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織是國際上廣泛采用的轉(zhuǎn)基因玉米受體類型，但由于生產(chǎn)上使用的玉米骨干自交系胚性愈傷組織誘導(dǎo)率普遍很低，而不能直接作為轉(zhuǎn)基因的受體材料。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因玉米育種流程要經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化、自交純合、回交轉(zhuǎn)育及雜交組培幾個環(huán)節(jié)，一般從轉(zhuǎn)基因陽性材料自交純合到回

2、交轉(zhuǎn)育獲得轉(zhuǎn)基因骨干自交系至少需要3～6年。玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)率因材料間基因型不同而差異較大，克隆控制胚性愈傷組織誘導(dǎo)率主效基因，解析玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)機(jī)理，創(chuàng)制更多的高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率玉米自交系有利于整個玉米轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域的快速發(fā)展。
　　本研究選取301份遺傳豐富、胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力具有代表性的自交系組成的自然群體和高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率自交系18-599R作為供試材料，結(jié)合全基因組關(guān)聯(lián)分析與Solexa數(shù)字基因表達(dá)譜等

3、手段鑒定控制胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力、調(diào)控胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程的的基因。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以遺傳豐富的301份玉米自交系為材料，通過2014年和2015年兩個環(huán)境種植材料，授粉12天左右，選取幼胚大小在1.0～1.5mm的玉米材料挑取幼胚接種到含有2，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷組織，于挑胚后第7天統(tǒng)計每個材料的芽長、出芽率，15，20，25天調(diào)查胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。經(jīng)過統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)其中胚性愈傷組織誘導(dǎo)率在40％～80％的

4、材料有3個，30％～40％的材料有3個，20％～30％的材料有12個，10％～20％的材料有25個，0％～10％的材料有69個，0％的材料有188個。
　　2.采用44243個最小等位基因頻率大于5％的高質(zhì)量SNP，結(jié)合群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系通過TASSEL軟件進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。兩個環(huán)境下共檢測到25個SNP與胚性愈傷組織顯著相關(guān)(P＜0.0001)，其中僅有1個兩環(huán)境下共性SNP分布于玉米染色體bin1.05，25個SNP共篩選

5、到15個候選基因。根據(jù)基因注釋功能發(fā)現(xiàn)這些候選基因可能參與蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、線粒體構(gòu)成、電子傳遞、蛋白激酶活性等生理生化過程。另外對出芽率和芽長也進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，兩個環(huán)境下共檢測到36個SNP與出芽率顯著相關(guān)，其中共同檢測到與出芽率顯著相關(guān)的SNP10個，28個SNP篩選到20個候選基因。根據(jù)基因注釋功能發(fā)現(xiàn)這些候選基因可能參與轉(zhuǎn)移酶活性，蛋白激酶活性，能量傳遞及異構(gòu)酶活性等功能。另外兩個環(huán)境下共檢測到53個SNP與芽長顯著相

6、關(guān)，共同檢測到與芽長顯著相關(guān)的SNP6個，31個SNP篩選到31個候選基因，根據(jù)基因注釋功能發(fā)現(xiàn)這些候選基因可能與磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)調(diào)節(jié)因子活性，解旋酶活性，甲基轉(zhuǎn)移酶活性，氧化還原酶活性及水解酶活性等功能相關(guān)。
　　3.以高誘導(dǎo)率自交系18-599為材料，將幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程劃分為胚膨大期、初級愈傷形成期、胚性愈傷組織形成期，利用數(shù)字表達(dá)譜(DGE)測序進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)果表明未培養(yǎng)幼胚(CK)、幼胚膨大期(StageⅠ)、初

7、級愈傷組織形成期(StageⅡ)、胚性愈傷組織形成期(StageⅢ)分別有18951(14.55％)，18359(56.42％)，18140(15.83％)，17870(15.5％)測序標(biāo)簽可以比對到玉米基因組上;分別在3個培養(yǎng)階段檢測到4825、5119、5463個差異表達(dá)的基因;在3個階段存在超過5倍表達(dá)水平差異的基因中分別有199、230、250個基因是上調(diào)表達(dá)。而下調(diào)表達(dá)的基因比較稀少，在3個時期分別僅有52、94、63個基因。

8、說明在玉米幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)過程激活了大量基因的表達(dá)。
　　4.COG分子功能注釋結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要參與細(xì)胞構(gòu)成，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，生理代謝等生物過程。KEGG Pathway分析結(jié)果表明StageⅠ中差異表達(dá)基因主要富集在脂肪酸生物合成，細(xì)胞色素代謝外源性物質(zhì)，α—亞麻酸新陳代謝途徑，StageⅡ中差異表達(dá)基因主要富集在丙酮酸鹽代謝，植物激素的生物合成，脂肪酸的生物合成，StageⅢ中差異表達(dá)基因主要富集在丙酮酸鹽代謝，糖酵解

9、/糖原異生，苯丙素類生物合成。另外，植物激素信號傳導(dǎo)通路也是三個階段均檢測到的顯著通路。
　　5.本研究通過關(guān)聯(lián)分析研究遺傳豐富的301份玉米自交系材料胚性愈傷組織率，篩選與胚性愈傷組織誘導(dǎo)率相關(guān)基因，同時通過數(shù)字基因表達(dá)譜研究高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率材料18-599R幼胚（對照），1～5天(StageⅠ)、6～10天(StageⅡ)、11～15天(StageⅢ)材料，尋找幼胚在脫分化時期的差異表達(dá)基因。將通過關(guān)聯(lián)分析篩選得到的相關(guān)候

10、選基因與差異表達(dá)基因進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)與三個性狀顯著關(guān)聯(lián)的相關(guān)候選基因有一部分也能在差異表達(dá)基因中找到。這些共性基因?qū)⑹呛罄m(xù)實(shí)驗(yàn)關(guān)注的重點(diǎn)。
　　6.我們對植物激素信號傳導(dǎo)通路中由MYB138介導(dǎo)的GA信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)外源GA3通過促進(jìn)玉米幼胚不定芽的生長而抑制胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。ZmMYB138基因的擬南芥同源基因突變體atmyb65比野生型COL胚性愈傷組織誘導(dǎo)率下降了約20％，這部分葉片組織在誘導(dǎo)過程中產(chǎn)生變態(tài)