HMGA2和ERCC1在肺腺癌中的表達(dá)及對化療敏感性影響的研究.pdf

1、目的：
　　 近年來,肺癌的發(fā)病率明顯升高已經(jīng)成為不爭的事實(shí),已經(jīng)引起廣泛重視,在一些發(fā)達(dá)國家和地區(qū)男性肺癌的發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤之首,女性發(fā)病率雖然僅次于乳腺癌而居第二位,但其死亡率卻占第一位。每年新發(fā)病例數(shù)已達(dá)百萬計(jì)。并在所有惡性腫瘤中導(dǎo)致的死亡率中占第一位,嚴(yán)重威脅人民群眾的生命。
　　 目前肺癌的治療仍是以手術(shù)為主的綜合治療,雖然近年來包括一些新的治療手段的采用如分子靶向治療和新輔助化療,但肺癌總的預(yù)后仍

2、然很差,五年生存率在15%-20%,主要原因是肺癌的轉(zhuǎn)移。肺癌的轉(zhuǎn)移方式包括直接蔓延,血道轉(zhuǎn)移和淋巴道轉(zhuǎn)移。其中淋巴道轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移方式,據(jù)統(tǒng)計(jì)約半數(shù)以上的肺癌病例有肺內(nèi),肺門或縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而且縱隔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移居多。這是影響肺癌預(yù)后的主要因素之一。
　　 近年來,HMGA2與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。HMGA2是一種核非組蛋白,也是構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子,在活體內(nèi)他們不僅是染色質(zhì)的構(gòu)建組成成分,而且是輔助基因轉(zhuǎn)錄成分。并且在多種良

3、性疾病和良、惡性腫瘤中都有表達(dá),表明HMGA2在細(xì)胞分化和增殖中扮演重要角色,而且在哺乳類動(dòng)物的生長和發(fā)育中有重要作用?？赡苁悄[瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后的預(yù)測因子。
　　 目前,HMGA2在肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)研究較少,還沒有關(guān)于在HMGA2與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性的報(bào)道,也沒有肺腺癌組織中HMGA2和ERCC1基因相關(guān)性的研究報(bào)道。HMGA2在肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及使用抗HMGA2特異性抗體治療肺腺癌轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究尚未見報(bào)道。

4、r>　　 本研究探討在肺腺癌中HMGA2和ERCC1基因的表達(dá),分析兩者調(diào)控的相關(guān)性及HMGA2與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性并預(yù)測肺腺癌淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可行性。并研究抗HMGA2特異性抗體對肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549生物學(xué)行為的影響。通過抗HMGA2特異性抗體聯(lián)合化療藥物作用于肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,研究抗HMGA2特異性抗體協(xié)同常規(guī)化療藥治療肺腺癌的可能性。
　　 方法：
　　 1、以肺腺癌組織為模型,采用抗HMGA2單克隆抗

5、體,抗ERCC1單克隆抗體以免疫組化法和western-blot法檢測在正常肺組織,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌和非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中兩種蛋白的表達(dá)狀況。研究兩種蛋白在這些組織中的表達(dá)差異性和相關(guān)性。采用Realtime-PCR法檢測上述組織中HMGA2mRNA和ERCC1mRNA的含量和差異性。采用RT-PCR法及測序法檢測在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織之間HMGA2基因的編碼區(qū)有

6、無基因序列的差異。
　　 2、采用體外細(xì)胞培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,抗HMGA2特異性抗體干擾A549,MTT法檢測干擾作用前后A549細(xì)胞系的增殖活性變化。用western-blot法和Realtime-PCR法檢測抗HMGA2特異性抗體干擾A549前后HMGA2蛋白和mRNA的變化情況。并就抗HMGA2特異性抗體對肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的生長抑制的影響進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 3、使用三種不同濃度的常用化療藥物紫杉醇、V

7、P16和DDP與抗HMGA2特異性抗體聯(lián)合作用于肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,MTT法檢測不同濃度和不同時(shí)間作用后肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的增殖變化,探討抗HMGA2特異性抗體與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用在肺腺癌化療中的治療作用和意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、肺腺癌組織中HMGA2和ERCC1的表達(dá)及相關(guān)性
　　 (1)肺腺癌組織中HMGA2和ERCC1表達(dá)情況:免疫組化結(jié)果顯示HMGA2在正常肺組織,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織,有淋

8、巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率分別為0%,54.2%,81.6%,與正常肺組織相比,肺腺癌組織HMGA2蛋白表達(dá)陽性率有顯著差異(P＜0.01);與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織比較,HMGA2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中的陽性表達(dá)率也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。HMGA2在非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移痛組織中的蛋白表達(dá)陽性率分別為0%,47.3%,兩者的HMGA2表達(dá)陽性率有顯著差異(P＜0.01);與周圍正常肺組織相比表達(dá)有明顯差異(P

9、＜0.01)。在肺腺癌組織中,低分化腺癌強(qiáng)陽性表達(dá)率高于高分化肺腺癌組織,兩者表達(dá)有顯著差異(P＜0.01)。ERCC1在正常肺組織,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織,非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的蛋白表達(dá)表達(dá)陽性率分別為12.7%,2.5%,0%,8.6%,0%,與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌相比,在正常肺組織中的表達(dá)有顯著差異(P＜0.01)。Western-blot法顯示相同的結(jié)果。
　

10、　 (2)HMGA2在肺腺癌組織中的表達(dá)陽性率明顯高于ERCC1,兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-11.347,P＜0.001)。
　　 (3)HMGA2mRNA在腫腺癌組織中表達(dá)含量高,在正常肺組織中表達(dá)表達(dá)含量低,兩者的表達(dá)含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。在肺腺癌組織中,低分化腺癌中表達(dá)含量高于高分化肺腺癌組織,兩者表達(dá)有顯著差異(P＜0.01)。在非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中呈現(xiàn)低表達(dá)含量,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中呈現(xiàn)高表達(dá)含量,兩者HMGA2

11、mRNA表達(dá)量有顯著差異(P＜0.01)。在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫腺癌組織中的表達(dá)量明顯低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 (4)采用RT-PCR法及測序法檢測在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織之間HMGA2基因編碼區(qū)無基因序列的差異。
　　 2、抗特異性HMGA2抗體對肺腺癌系A(chǔ)549增殖影響的相關(guān)研究
　　 (1)MTT結(jié)果提示,隨著抗特異性HMGA2抗體劑量增加和作用

12、時(shí)間延長,A549細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)抑制,并表現(xiàn)出劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　 (2)Realtime-PCR和Western-blot結(jié)果證實(shí)抗特異性HMGA2抗體干擾后,A549細(xì)胞株中HMGA2蛋白和mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)。
　　 3、抗特異性HMGA2抗體對化療敏感性的影響
　　 抗HMGA2特異性抗體作用于A549細(xì)胞株,MTT結(jié)果提示三種常用化療藥物對A549細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng),呈現(xiàn)出劑量依賴性和時(shí)

13、間依賴性。說明抗HMGA2特異性抗體干擾后,三種化療藥物對A549細(xì)胞的敏感性提高。提示抗HMGA2特異性抗體與化療藥物聯(lián)合治療腫腺癌呈現(xiàn)有效性并表現(xiàn)出協(xié)同作用。
　　 結(jié)論：
　　 1、HMGA2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫腺癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中高表達(dá),提示HMGA2與肺腺癌的惡性程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性,也進(jìn)一步說明它可能是肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)提示因子。并可能是肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)治療靶點(diǎn)。
　　 2、HMG

14、A2在肺腺癌組織中高表達(dá)和ERCC1低表達(dá),兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。
　　 3、A549細(xì)胞中HMGA2表達(dá)的下調(diào)可以通過抗HMGA2特異性抗體的作用而實(shí)現(xiàn)。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗HMGA2特異性抗體可以下調(diào)A549細(xì)胞中HMGA2的表達(dá)從而表現(xiàn)抑制肺腺癌轉(zhuǎn)移的作用。
　　 4、抗HMGA2特異性抗體通過下調(diào)HMGA2,提高常用化療藥物對肺腺癌A549細(xì)胞系的敏感性,因此有協(xié)同作用,可以成為腫腺癌藥物