缺氧微環(huán)境對(duì)胰腺癌化療敏感性的影響及其逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、[目的]：探討胰腺癌組織中微環(huán)境缺氧存在與否及其與胰腺癌患者健擇化療耐藥的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制,分析靶向缺氧及HIF-1a對(duì)胰腺癌健擇耐藥的逆轉(zhuǎn)作用,為進(jìn)一步研究胰腺癌的治療方法及逆轉(zhuǎn)耐藥提供了新的理論依據(jù). [方法]：免疫組化分析34例胰腺導(dǎo)管腺癌組織中HIF-1a、P-Gp、Bcl-X<,L>、Bax表達(dá),比較其與10例正常胰腺組織中HIF-1a的表達(dá)情況的差異,分析腫瘤組織中HIF-1a與P-Gp、Bcl-XL、Bax表

2、達(dá)的相關(guān)性.利用厭氧菌培養(yǎng)檢測(cè)設(shè)備構(gòu)建微環(huán)境缺氧模型,MTT法檢測(cè)缺氧與常氧環(huán)境及使用HIF-1a抑制劑條件下兩株細(xì)胞對(duì)健擇IC<,50>的改變,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧與常氧環(huán)境下兩細(xì)胞株細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期變化情況,RT-PCR及Western-blot的方法檢測(cè)HIF-1a及mdrl/P-Gp、Bcl-X<,L>、Bax基因即蛋白水平表達(dá)的影響,據(jù)此分析缺氧誘導(dǎo)胰腺癌耐藥可能的分子生物學(xué)機(jī)制. [結(jié)果]：34例胰腺癌腫瘤組織中HI

3、F-1a表達(dá)陽(yáng)性的有26例(76.5﹪),而正常胰腺組織的導(dǎo)管和腺泡結(jié)構(gòu)中均未見HIF-1a陽(yáng)性表達(dá),HIF-1a和.P-Gp、Bcl-X<,L>、Bax蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(P=0.005,P=0.009,P=0.002).缺氧微環(huán)境下胰腺癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的形態(tài)學(xué)的改變,可能與引起耐藥的分子生物學(xué)改變相關(guān).MTT法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株對(duì)健擇耐藥性的改變的結(jié)果表明,常氧條件下胰腺癌細(xì)胞株SWl990對(duì)健擇的IC<,50>為4.896±0.05μg

4、/ml,缺氧培養(yǎng)48小時(shí)后為85.050±3.407μg/ml,是常氧時(shí)的17倍.胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1對(duì)健擇的IC<,50>為51.727±3.15μg/ml,而缺氧培養(yǎng)48小時(shí)后,Panc-1/H48對(duì)健擇的IC<,50>為208.805±15.882μg/ml,是常氧時(shí)的4倍.應(yīng)用小分子HIF-1a抑制劑YC-1后,各細(xì)胞株在缺氧培養(yǎng)48小時(shí)后對(duì)健擇的IC<,50>均有不同程度的顯著下降,SWl990/H48Y的IC<,50>為

5、37.218±3.690μg/ml,Panc-1/H48Y的IC50為164.002±11.05μg/ml.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示隨著缺氧時(shí)間的增加,SW1990細(xì)胞的凋亡比率呈時(shí)間依賴性增加,即誘導(dǎo)凋亡.而Panc-1細(xì)胞隨著缺氧時(shí)間的增加,凋亡比率呈時(shí)間依賴性減低,即出現(xiàn)凋亡抑制.使用碘化丙錠法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果表明,隨著缺氧時(shí)間的增加,SW1990細(xì)胞周期中G<,2>/M期細(xì)胞顯著增加,而S期細(xì)胞則顯著減少,Panc-1細(xì)胞周

6、期出現(xiàn)G<,1>/S期阻滯.常氧環(huán)境下,胰腺癌細(xì)胞株SW1990及Panc-1均存在HIF-1a及Bcl-X<,L>、Bax mRNA水平的高表達(dá),而mdr1則存在較低水平的mRNA表達(dá),隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),兩株細(xì)胞中Bcl-X<,L>、Bax mRNA及Panc-1細(xì)胞株中mdrl mRNA的表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增強(qiáng),且較常氧條件下均有顯著性差異(P<0.05).常氧環(huán)境下,胰腺癌細(xì)胞株SW1990存在:HIF-1a及P-Gp、Bcl-

7、X<,L>、Bax蛋白水平的高表達(dá),而Panc-1則存在較低水平的HIF-1a、P-Gp、Bcl-X<,L>、Bax蛋白表達(dá).兩株細(xì)胞中HIF-1a、P-Gp、Bcl-X<,L>、Bax及Panc-1細(xì)胞株中Bcl-X<,L>蛋白水平表達(dá)均呈時(shí)間依賴性增強(qiáng),且較常氧條件下均有顯著性差異.使用小分子HIF-1a抑制劑YC-1特異性抑制HIF-1a蛋白表達(dá)后,兩細(xì)胞株中的mdr1、Bax mRNA表達(dá)及Panc-1細(xì)胞中Bcl-X<,L>

8、mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比被顯著抑制.使用小分子HIF-1a抑制劑YC-1特異性抑制HIF-1a蛋白表達(dá)后,兩細(xì)胞株中的HIF-1a、P-Gp、Bax蛋白表達(dá)及Panc-1細(xì)胞中Bcl-X<,L>蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比被顯著抑制. [結(jié)論]：人胰腺癌組織中存在微環(huán)境缺氧及HIF-1a的過度表達(dá);微環(huán)境缺氧能誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞株對(duì)健擇耐藥性提高,其中的機(jī)制可能涉及缺氧介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制與細(xì)胞周期阻滯,使健擇失去作用靶點(diǎn)所至;微環(huán)境缺氧可能