胸苷酸合成酶基因多態(tài)性與胰腺癌化療敏感性的關(guān)系.pdf

1、胰腺癌惡性程度高,進展快,目前是西方國家第4位致死腫瘤,在我國的發(fā)病率也逐年上升。85％的胰腺癌患者在就診時已喪失手術(shù)機會,其預(yù)后差,中位生存時間不足6個月,5年生存率為0.4—5％[1]。以化療為核心的輔助治療成為胰腺癌治療的關(guān)鍵,目前在胰腺癌術(shù)后輔助化療方面5-FU與健擇是主要的選擇藥物,盡管近年來新的化療藥和改進的聯(lián)合化療方案不斷推出,但化療效果并不理想,而化療個體化可能是提高臨床療效的有效途徑之一?；焸€體化治療首先要解決的是腫

2、瘤藥物敏感性的問題,近年來隨著對人類個體基因差異的深入理解,發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性與腫瘤化療密切相關(guān),胸苷酸合成酶(Thymidylate Synthase,TS)是嘧啶再合成及5-FU代謝過程中的關(guān)鍵酶[2],目前研究表明TS基因存在多態(tài)性,而不同基因型其表達可能存在差異,從而影響腫瘤患者的臨床療效,因此目前TS基因多態(tài)性與化療療效的相互關(guān)系引起了越來越多學(xué)者的重視。
　　 膠原凝膠微滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)(collagen gel.dr

3、oplet culturedrug—sensitivity test,CD—DST)是一種新的腫瘤體外藥敏檢測技術(shù)[3],既往研究選用的胰腺癌體外藥物敏感性檢測多為體外二維單層培養(yǎng)的細胞模型,但是由于人體內(nèi)的胰腺癌組織是一個三維細胞群體,腫瘤本身作為一個整體而具有與其單個腫瘤細胞不同的特性,腫瘤細胞之間不但相互作用和影響而且腫瘤細胞受到所處的微環(huán)境的影響,而體外二維單層培養(yǎng)的細胞模型不能很好的模擬體內(nèi)環(huán)境,CD—DST技術(shù)使細胞在凝固的

4、鼠尾Ⅰ型膠原里生長,細胞分裂成細胞團,腫瘤細胞生長狀態(tài)更加接近生理,從而使藥敏結(jié)果更加真實可信。
　　 研究目的:
　　 擬通過對多株胰腺癌細胞株、臨床胰腺癌患者外周血淋巴細胞、患者術(shù)后原代培養(yǎng)的胰腺癌細胞、病理組織及接受5-FU化療患者療效隨訪等多方面研究,分析胸苷酸合成酶(Thymidylate Synthase,TS)基因多態(tài)性與5-FU化療敏感性的關(guān)系,研究不同基因型胰腺癌細胞對5-FU化療效果的差異,探索可靠的

5、胰腺癌化療預(yù)測指標,從而為胰腺癌的個體化治療提供新途徑。
　　 研究方法:
　　 提取胰腺癌患者外周血及7株人胰腺癌細胞DNA后,TS基因增強子區(qū)(TS enhancerregion,TSER)存在28bp串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性使用PCR擴增TS目的DNA片段,直接測序檢測目的片段序列,毛細管電泳結(jié)果使用GENEMARKER軟件分析基因型。TS基因SNP位點檢測采用直接測序法,DNAMAN軟件比對測序結(jié)果,對樣本DNA的SN

6、P位點進行基因分型。使用real-time PCR檢測人胰腺癌細胞株中不同基因型細胞TS mRNA表達差異,使用Western Blotting檢測其TS蛋白表達水平。利用CCK-8試劑盒檢測7株胰腺癌細胞對5-FU的化療敏感性,臨床胰腺癌標本的體外藥敏檢測通過鼠尾膠原建立以三維培養(yǎng)為平臺的膠原凝膠微滴腫瘤藥敏檢測技術(shù)(CD—DST)檢測。胰腺癌患者癌組織TS蛋白表達檢測使用免疫組化法并且對于接受5-FU化療患者進行隨訪。數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用S

7、PSS11.0軟件對正態(tài)分布的計量資料進行單因素方差分析,患者生存率評估使用kaplan—Meier分析,當p值小于0.05認為具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.TS基因多態(tài)性檢測結(jié)果:發(fā)現(xiàn)TS基因增強子區(qū)(TS enhancer region,TSER)存在28bp串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性,28 bp串聯(lián)重復(fù)序列有2次重復(fù)(2R)與3次重復(fù)(3R)。根據(jù)重復(fù)次數(shù)不同基因型可分為2R/2R、2R/3R、3R/3R

8、三種,其中人胰腺癌細胞基因型為2R/2R:T3M4與BxPC-3；2R/3R:ASPC-1,Capan-1與SU86.86；3R/3R:PANC-1與COL0357。
　　 2.31例胰腺癌患者中TS基因型2R/2R為48.4％(15例),2R/3R為22.6％(7例),3R/3R為29.0％(9例)。
　　 3.RT—PCR結(jié)果表明:人胰腺癌細胞不同基因型TS基因mRNA表達存在差異,3R/3R基因細胞TS mRNA表

9、達高于其它基因型,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4.Western Blotting結(jié)果表明:細胞株AsPC-1,BxPC-3,Capan-1,SU86.86,T3M4中TS蛋白表達水平低(低TS表達組),而PANC-1與COL0357中TS蛋白表達水平較高(高TS表達組),低TS表達組TS基因型為2R/2R與2R/3R,高TS表達組基因型為3R/3R。基因型2R/2R,2R/3R與3R/3R光密度值分別為0.56

10、8±0.032,0.561±0.056與1.393±0.374,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5.CCK-8結(jié)果表明:基因型為2R/2R的細胞在低中高3個不同藥物濃度下對5-FU抑制率分別為0.811±0.090,0.880±0.067和0.922±0.038；基因型為2R/3R的細胞對5-FU抑制率分別為0.595±0.065,0.695±0.070和0.780±0.075,同濃度下基因型為3R/3R的細胞對5-F

11、U抑制率分別為0.370±0.157,0.548±0.018與0.638±0.020。不同藥物濃度下基因型為3R/3R的細胞對5-FU的藥物抑制率均明顯低于其他組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 6.細胞凋亡檢測:通過Annexin V-FITC/PI檢測細胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同基因型細胞加入5-FU作用72h后,2R/2R(BxPC-3)基因型細胞的凋亡率顯著高于3R/3R(COL0357)及2R/2R(ASPC-1)

12、基因型細胞,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 7.CD—DST結(jié)果顯示:3R/3R(P1)基因型的患者胰腺癌細胞抑制率為24.93±4.88。2R/2R(P2,P3,P4)基因型的患者胰腺癌細胞抑制率分別是40.70±3.33,35.95±3.94。47.94±4.38。3R/3R基因型的胰腺癌患者抑制率著低于2R/2R基因型,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 8.免疫組化結(jié)果顯示:TS蛋白表達水平與患

13、者的年齡,性別,手術(shù)切緣,腫瘤大小,腫瘤組織類型,TNM分期,有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無其他組織或臟器轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。胰腺癌組織中TS蛋白表達與患者病理分型及基因型密切相關(guān),在胰腺癌組織中2R/2R、2R/3R基因型TS蛋白表達陽性率為40.9％(9/22),3R/3R基因型TS蛋白表達陽性率為88.9％(8/9),3R/3R基因型TS蛋白陽性表達率明顯高于2R/2R及2R/3R基因型(P=0.021)。TS蛋白在不同病理分級病

14、人中的陽性表達情況有所差別,在胰腺癌低分化組TS蛋白表達陽性率為90.9％(10/11),中高分化組TS蛋白表達陽性率為35.0％(7/20),低分化組TS蛋白表達陽性率明顯高于中高分化組(P=0.007)。
　　 9.胰腺癌患者實施接受以5-FU為基礎(chǔ)的化療后持續(xù)隨訪,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3R/3R基因型患者生存率(Overall survival,OS)比2R/2R或2R/3R基因型患者更低(p=0.007),而無瘤生存率(progre

15、ssion—free survival,PFS)在3R/3R基因型患者與2R/2R或2R/3R基因型患者之間同樣存在顯著差別,3R/3R基因型患者PFS更低(p=0.035)。生存曲線顯示TS蛋白表達陰性組患者預(yù)后相對較好,無論是OS還是PFS都比TS蛋白陽性表達組高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義OS(P<0.05)PFS(P=0.001),TS的表達水平與患者的預(yù)后呈負相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實驗通過檢測人胰腺癌細胞株T

16、S基因5’UTR多態(tài)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的癌細胞TS基因型有差別,且在被測胰腺癌患者中TS基因型分布2R/2R純合基因型患者比例最高,其次為3R/3R及2R/3R基因型患者。
　　 2.人胰腺癌細胞中TS不同基因型與其蛋白表達水平密切相關(guān),3R/3R基因型細胞TS蛋白表達水平較高,免疫組化結(jié)果同樣提示3R/3R基因型患者胰腺癌組織中TS蛋白表達水平較高。
　　 3.人胰腺癌細胞株使用cck-8法進行的5-FU體外化療敏感性檢

17、測及4名胰腺癌患者使用CD—DST進行的5-FU體外化療敏感性檢測均顯示TS基因多態(tài)性與5-FU化療敏感性密切相關(guān),胰腺癌3R/3R基因型細胞比2R/2R與2R/3R基因型細胞對5-FU化療敏感性更低。
　　 4.人胰腺癌細胞中TS蛋白表達水平與體外細胞對5-FU的化療敏感性密切相關(guān),TS蛋白高表達的胰腺癌細胞5-FU的抑制率低。
　　 5.TS基因型與胰腺癌患者化療預(yù)后密切相關(guān),接受以5-FU為基礎(chǔ)的化療后,3R/3R