紫外誘導(dǎo)圓錐鐵線蓮中吲哚生物堿合成機理研究及CtIPT的克隆與原核表達(dá)分析.pdf

1、中國是藥用植物資源最豐富的國家之一，而藥用植物在人類疾病預(yù)防和治療中占有重要地位。UV-B對藥用植物的生長發(fā)育和次生代謝影響很大，但是，不同藥用植物對UV-B的具體響應(yīng)情況有所不同，許多機理有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)。吲哚生物堿是藥用植物中非常具有研究價值的一類次生代謝產(chǎn)物，在UV-B逆境下含量增加，不僅能夠增強植物自我保護(hù)能力以抵御逆境脅迫，還具有細(xì)胞毒性、抗癌、抗病毒、抗瘧和抗炎等功效，能夠直接增加植物的藥用價值。細(xì)胞分裂素是由腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)

2、移酶合成的一類植物激素，在UV-B逆境下含量減少，不僅能夠調(diào)控藥用植物生長發(fā)育使其形態(tài)學(xué)發(fā)生改變而處于抵御逆境脅迫的狀態(tài)，還可能與UVR8信號通路中的某些調(diào)控因子相關(guān)，參與調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物的合成（如吲哚生物堿、香豆素、黃酮等），能夠間接增加植物的藥用價值。
　　圓錐鐵線蓮屬于毛茛科，具有非常高的藥用價值。實驗室前期從圓錐鐵線蓮中分離出了吲哚生物堿(6-hydroxyl-1H-indol-3-yl) carboxylic aci

3、d methyl ester，本課題在該研究成果的基礎(chǔ)上進(jìn)行了更深入的研究，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)圓錐鐵線蓮中吲哚生物堿響應(yīng)UV-B誘導(dǎo)的合成機理
　　HPLC-TOF-MS/MS分析顯示圓錐鐵線蓮經(jīng)過UV-B誘導(dǎo)后其吲哚生物堿(6-hydroxyl-1H-indol-3-yl) carboxylic acid methyl ester含量增加，表明圓錐鐵線蓮在UV-B誘導(dǎo)下體內(nèi)吲哚生物堿合成途徑呈增強狀態(tài)。基

4、于2-DE和GC-TOF-MS技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究揭示了圓錐鐵線蓮經(jīng)UV-B誘導(dǎo)后吲哚生物堿的合成機理，即與氨基酸代謝相關(guān)的蛋白和化合物含量顯著增加，表明氨基酸代謝被激活。
　　通過對絲氨酸脫氨酶進(jìn)行酶活檢測，結(jié)果顯示該酶活經(jīng)過UV-B誘導(dǎo)后顯著增強，表明氨基酸代謝過程被UV-B輻射激活能夠促進(jìn)下游莽草酸代謝途徑的增強?；趒RT-PCR技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究分析了圓錐鐵線蓮經(jīng)UV-B誘導(dǎo)后吲哚生物堿合成途徑上關(guān)鍵基因的變化

5、情況，結(jié)果顯示從莽草酸到色氨酸代謝過程中的8個關(guān)鍵基因的表達(dá)表現(xiàn)出上調(diào)共性;通過HPLC-TOF-MS/MS代謝組檢測圓錐鐵線蓮經(jīng)UV-B誘導(dǎo)后吲哚生物堿合成途徑上關(guān)鍵化合物的變化情況，結(jié)果顯示鄰氨基苯甲酸鹽、吲哚和色氨酸的含量都增加;通過對色氨酸合成酶進(jìn)行酶活檢測，結(jié)果顯示該酶活經(jīng)過UV-B誘導(dǎo)后顯著增強，上述結(jié)果均表明增強了的莽草酸代謝途徑能夠促進(jìn)吲哚生物合成途徑的增強，最終為吲哚生物堿的合成奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)圓錐鐵線蓮

6、中腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的克隆與原核表達(dá)
　　借助轉(zhuǎn)錄組測序，我們獲得了圓錐鐵線蓮葉片中腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的EST片段，之后利用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術(shù)(rapid amplification ofcDNA ends，RACE)，得到了長度為1374 bp的堿基序列，其中包括長度為332 aa的完整ORF區(qū)。接著對該序列編碼的蛋白CtIPT進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測、序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示該蛋白是一個分子量為37.

7、2 kDa的親水性蛋白，存在腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶特征序列區(qū)域(ATP/GTP結(jié)合序列區(qū)域)，且與番茄中的SlIPT3/4和擬南芥中的AtIPT3/5/7非常相似，表明該蛋白為腺苷酸異戊烯基轉(zhuǎn)移酶。然后通過qRT-PCR檢測UV-B誘導(dǎo)對CtIPT表達(dá)的影響，結(jié)果顯示具有顯著性抑制作用，表明CtIPT可能具有抵御紫外逆境脅迫的功能。再分別以pET-28a(+)、pGEX-4T-1和pMAL-c2X質(zhì)粒為表達(dá)載體對CtIPT進(jìn)行克隆，并在大