內(nèi)生真菌溜曲霉中吲哚二酮哌嗪類生物堿的代謝調(diào)控及機理探討.pdf

1、內(nèi)生真菌溜曲霉在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生吲哚二酮哌嗪類生物堿(indole diketopiperazine alkaloids，IDAs），這類化合物是色氨酸和其它氨基酸形成的環(huán)二肽，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等生物活性。本課題以植物內(nèi)生真菌溜曲霉為研究對象，以IDAs的化學結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，研究了溜曲霉的生長規(guī)律；建立了反相高效液相色譜測定IDAs的方法；在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化了溜曲霉產(chǎn)生IDAs的發(fā)酵條件；比較了發(fā)

2、酵液及菌絲體中IDAs的含量，發(fā)現(xiàn)了超聲波輔助溶劑萃取法提高菌絲體中IDAs的萃取量；研究了氨基酸種類、加量、加入時間等對IDAs形成和積累的影響，探索了氨基酸調(diào)控溜曲霉次生代謝的原因；通過差異基因的研究，從分子水平上，揭示了氨基酸調(diào)節(jié)溜曲霉代謝產(chǎn)物的機理。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴建立了反相高效液相色譜測定IDAs的方法，色譜條件如下：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈和0.7％的三乙胺水溶液（體

3、積比為1:3）；流速為1.0 mL/min；柱溫為常溫；二極管陣列檢測器；進樣量20μL；波長范圍250～300 nm。在此條件下進行測定，測定結(jié)果的準確性、穩(wěn)定性較好，可用于溜曲霉發(fā)酵液中IDAs的測定。⑵通過顯色反應(yīng)發(fā)現(xiàn)溜曲霉次生代謝產(chǎn)物的主要活性成分為吲哚二酮哌嗪類生物堿(IDAs)，利用 K-B藥敏平板法發(fā)現(xiàn)溜曲霉次生代謝產(chǎn)物 IDAs具有抑制枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金色葡萄球菌(Staphyloco

4、ccus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichia coli)、小麥赤霉病菌(Fusarium Graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. Niveum)、芍藥炭疽病菌(Colletotirchum gloeosporioides)、辣椒

5、疫霉病菌(Phytophthora capsici)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)生長的作用，從而證實溜曲霉次生代謝產(chǎn)物IDAs具有很好的抗菌活性。⑶在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法，研究了發(fā)酵溫度，初始pH，裝液量，接種量對溜曲霉次生代謝產(chǎn)物IDAs產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)溜曲霉在發(fā)酵溫度為28℃，初始pH為7.0，接種量為7.6%，裝液量為360 mL/L的條件下，發(fā)酵14天，次生代謝產(chǎn)物IDAs的產(chǎn)量最高。

6、⑷比較了溜曲霉發(fā)酵液及菌絲體中 IDAs的含量，發(fā)現(xiàn)溜曲霉代謝產(chǎn)物IDAs主要集中在發(fā)酵液中，從而得知IDAs是溜曲霉的胞外產(chǎn)物。⑸研究氨基酸種類、加量、加入時間等對溜曲霉次生代謝物IDAs產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵第8天加入氨基酸，且加入量為0.003 mol/L時比較合適。氨基酸種類對溜曲霉次生代謝產(chǎn)物的影響差異較大，以絲氨酸為代表的8種氨基酸能夠促進溜曲霉次生代謝產(chǎn)物形成和積累，以脯氨酸為代表的12種氨基酸能夠抑制溜曲霉次生代謝產(chǎn)物的形

7、成和積累，這為氨基酸調(diào)控溜曲霉代謝產(chǎn)物機制的研究提供了素材。⑹采用高通量測序技術(shù)對溜曲霉基因轉(zhuǎn)錄組進行測序，發(fā)現(xiàn)氨基酸誘導調(diào)節(jié)過程中影響其吲哚二酮哌嗪類生物堿（IDAs）產(chǎn)量的基因共有1366個，主要基因有58個，關(guān)鍵基因5個，其表達的酶分別為：乙酰輔酶A脫氫酶，乙醇脫氫酶，丙酮酸脫氫酶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶和6-磷酸果糖激酶。進一步研究表明：通過加入氨基酸對溜曲霉產(chǎn)生 IDAs的調(diào)控不是直接影響IDAs生物合成途徑中的酶，而是通過影