人羊膜上皮細(xì)胞凍存前后生物學(xué)特性比較及其對(duì)脂多糖致肺損傷干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　1、液氮深低溫保存人羊膜上皮細(xì)胞（human Amniotic Epithelial Cells，hAECs）是否會(huì)對(duì)其干細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，相關(guān)報(bào)道較少見。本研究從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物及干細(xì)胞基因表達(dá)、細(xì)胞體外成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化四個(gè)方面，來觀察 hAECs凍存前后的生物學(xué)活性和干細(xì)胞特性，以研究液氮深低溫保存hAECs的可靠性。
　　2、膿毒血癥仍然是導(dǎo)致急性肺損傷（acu

2、te lung injury，ALI）最常見的原因，目前尚缺乏十分有效的治療手段。本研究通過檢測(cè)肺組織病理學(xué)切片、肺組織和血清中細(xì)胞因子的變化，來觀察 hAECs對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的干預(yù)作用及其可能機(jī)制，以探討人羊膜上皮細(xì)胞治療急性肺損傷的可行性。
　　方法：
　　1、取健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)后胎盤的羊膜組織，采用多次胰酶消化法獲取hAECs，培養(yǎng)過程中經(jīng)多次差別消化法逐步純化hAECs。調(diào)整純化的第2代（P2）細(xì)胞密度至5×10

3、6/mL，向細(xì)胞中緩慢加入新鮮配制的二甲基亞砜（DMSO）凍存液。將凍存管置于程序降溫儀中，待溫度降至-100℃后迅速移入液氮罐中保存。1個(gè)月后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察凍存前后 hAECs的形態(tài)變化及增殖情況；并用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD29、CD73、CD166、CD44、CD90、HLA-ABC、CD34）；用RT-PCR法檢測(cè)Oct-4及 Nanog干細(xì)胞基因表達(dá)；同時(shí)在體外誘導(dǎo)hAECs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化。數(shù)

4、據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法分析兩組間的差異。
　　2、向新生SD大鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌內(nèi)毒素溶液20μL/g(5mg/kg)，制備脂多糖致急性肺損傷的動(dòng)物模型。造模后2h經(jīng)氣管滴入CM-Dil熒光標(biāo)記好的P2代hAECs。動(dòng)物隨機(jī)分組如下：（A）正常組（n=5）；（B）模型組（LPS）（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg；（C）細(xì)胞組（n=5）：腹腔內(nèi)

5、注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注hAECs（5×105個(gè)cells/40μL）；（D）對(duì)照組（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注40μLPBS液。分別在輸注細(xì)胞24h、72h后，處死動(dòng)物收取標(biāo)本，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只大鼠。取肺組織標(biāo)本固定，HE染色后觀察肺損傷程度，測(cè)量肺損傷病理評(píng)分、肺泡間隔的厚度，測(cè)量肺干濕比（D/W）。用ELISA免疫吸附法檢測(cè)肺組織丙二醛（MDA）濃度和超氧化物歧化酶（SOD）活性、同時(shí)檢測(cè)血清

6、中白介素10（IL-10）和白介素6（IL-6）的濃度。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，用單因素方差分析法分析組間差異。
　　結(jié)果：
　　1、hAECs凍存前后的形態(tài)學(xué)無明顯改變，均呈鋪路石樣膜狀生長(zhǎng)。與凍存前細(xì)胞相比，凍存后hAECs傳代時(shí)所需的消化時(shí)間有所縮短（P<0.05），但細(xì)胞活率、傳代時(shí)間、培養(yǎng)代數(shù)無明顯改變。凍存前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈S型，凍存后細(xì)胞與凍存前細(xì)胞

7、的生長(zhǎng)周期相比，細(xì)胞經(jīng)歷滯留期、對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期的時(shí)間無明顯差異。
　　2、凍存后hAECs仍可以表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記，CD73、CD29、CD166陽性率達(dá)90％以上，中度表達(dá)CD90、CD44，低表達(dá)I類白細(xì)胞抗原(HLA-ABC)，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34。RT-PCR法檢測(cè)Oct-4及 Nanog基因表達(dá)均呈陽性。體外誘導(dǎo)后，凍存前后的hAECs均可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化。
　　3、腹腔內(nèi)注射LPS后，肺組織可見

8、不同程度充血、血管內(nèi)皮損傷出血，部分肺泡萎陷不張，部分肺泡間隔增厚、破壞。模型組與正常組相比，肺損傷病理評(píng)分、肺泡間隔的厚度均有顯著增加（P<0.01）、肺干濕比減低（P=0.04）。檢測(cè)肺組織和血清中的生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)， MDA濃度有所升高伴SOD活性減低，模型組與正常組比較，兩者的變化都尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組血清中促炎癥因子IL-6水平逐漸升高，抗炎因子IL-10的水平逐漸減低，與正常組相比， IL-6水平24h為1

9、.25±0.01（P=0.762），72h為1.61±0.29（P=0.006）；IL-10的水平24h為13.68±1.14（P=0.219），72h為12.49±0.40（P=0.005），兩種因子在血清中的濃度變化72h時(shí)差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、輸入hAECs細(xì)胞后，細(xì)胞組與對(duì)照組相比，24h和72h時(shí)肺損傷評(píng)分、肺泡間隔厚度均有顯著降低（P<0.01），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞組中肺干濕比（D/W值）與對(duì)照組相比有所

10、升高，24h時(shí)P=0.046，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72h時(shí)P=0.366差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞組氧化因子MDA的濃度在肺組織中逐漸減低，抗氧化因子SOD活性逐漸升高，與對(duì)照組對(duì)比，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞組中促炎癥因子IL-6水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，與對(duì)照組相比72h時(shí)P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1、凍存后的hAECs除細(xì)胞貼壁性有所下降外，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)周期、細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)記