PPARα與大鼠心肌缺血缺氧及缺血再灌注關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分缺氧、缺氧再給氧對(duì)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α表達(dá)的影響 目的：研究缺氧、缺氧再給氧對(duì)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)表達(dá)影響，并觀察給予PPARα激動(dòng)劑Wy14643后對(duì)缺氧再給氧心肌細(xì)胞成活率的影響。 方法：采用體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組(normalcontrolgroup，NC組)，缺氧組(hypoxiagroup，H組)，缺氧再給氧組(hyp

2、oxia/reoxygenationgroup，HR組)，缺氧再給氧+Wy14643組(HRW組)。缺氧組將培養(yǎng)細(xì)胞缺氧90min)；缺氧再給氧組將培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧后復(fù)氧30min；缺氧再給氧+Wy14643組于缺氧后給予PPARα激動(dòng)劑Wy14643(終濃度150μmol/L)溫育40min。然后運(yùn)用半定量RT-PCR方法對(duì)心肌PPARαmRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析，運(yùn)用Western-blotting方法檢測(cè)PPAR蛋白表達(dá)情況，臺(tái)盼

3、藍(lán)染色法測(cè)定各組心肌細(xì)胞成活率。 結(jié)果：缺氧及缺氧再給氧組PPARαmRNA水平(分別為0.432±0.124及0.473±0.181)較正常對(duì)照組(0.874±0.137)顯著減少(P＜0.01)；缺氧及缺氧再給氧組蛋白表達(dá)(分別為63.88±14.22及70.35±13.48)較正常對(duì)照組(108.15±20.17)顯著減少(P＜0.01)；缺氧再給氧+Wy14643組PARαmRNA(1.810±0.437)及蛋白表達(dá)(2

4、02.18±52.47)較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)。缺氧組及缺氧再給氧組(44.1±3.7及51.3±2.8)心肌細(xì)胞成活率較正常對(duì)照組93.3±4.2顯著降低。缺氧再給氧+藥物組心肌細(xì)胞成活率為78.2±3.3，較缺氧組及缺氧再給氧組顯著升高(P＜0.01)。 結(jié)論：缺氧可顯著下調(diào)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞中PPARαmRNA及蛋白的表達(dá)，缺氧再給氧后mRNA及蛋白的表達(dá)未能恢復(fù)至正常水平，使用PPARα激動(dòng)劑后mRNA及蛋白

5、的表達(dá)得到顯著改善并使心肌細(xì)胞成活率顯著提高。 第二部分缺血及缺血再灌注對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α表達(dá)及血清游離脂肪酸水平的影響 目的：研究實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血再灌注對(duì)心肌過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的表達(dá)的及血清游離脂肪酸水平的影響。 方法：Wistar大鼠88只隨機(jī)分為四組：正常對(duì)照組(n=18)，假手術(shù)組(n=24)，缺血組(n=22)缺血再灌注組(n=24)。采用鼠心冠

6、狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制作在體缺血再灌注模型。運(yùn)用半定量RT-PCR方法分析心肌PPARαmRNA水平，運(yùn)用Western-blotting方法檢測(cè)PPARα蛋白表達(dá)情況。測(cè)定各組缺血再灌注后0h、2h、4h、6h、24h血清游離脂肪酸的含量。 結(jié)果：缺血及缺血再灌注組心肌PPARαmRNA(分別為0.402±0.117、0.455±0.139)較正常對(duì)照組及假手術(shù)組(分別為0.711±0.120、0.812±0.148)顯著減少

7、(P＜0.01)；缺血及缺血再灌注組心肌PPARα蛋白表達(dá)分別為(55.48±12.26、67.37±23.46)較正常對(duì)照組及假手術(shù)組(分別為110.49±19.77、102.18±12.56)顯著減少(P＜0.01)。正常對(duì)照組、假手術(shù)組及缺血再灌注組血清游離脂肪酸初始水平一致，而缺血再灌注組游離脂肪酸于再灌注后4h、6h顯著上升，分別達(dá)到(0.89±0.04、0.82±0.07)，24h后恢復(fù)至基礎(chǔ)水平，其余各組均無(wú)明顯變化。

8、 結(jié)論：在實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血及缺血再灌注心肌中PPARα表達(dá)減少同時(shí)伴有大鼠血液中游離脂肪酸在缺血再灌注后4～6h顯著升高。 第三部分激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α對(duì)大鼠缺血再灌注心肌的保護(hù)作用 目的：探討過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)激動(dòng)劑Wy14643對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血再灌注心肌心功能、梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡的影響。 方法：Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組，缺血再灌

9、注+不同劑量激動(dòng)劑Wy14643組(0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg)，每組各10只。采用鼠心冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制作在體缺血再灌注模型，觀察大鼠左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期末壓(LVDP)、左室壓力最大上升速率(+dp/max)、最大下降速率(-dp/max)，用TTC(氯化三苯甲基四氮唑)染色法測(cè)定心肌梗死范圍，并運(yùn)用半定量RT-PCR方法對(duì)心肌PPARαmRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析，運(yùn)用PI染色流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞

10、凋亡。 結(jié)果：①缺血再灌注+Wy14643(1mg/kg、2mg/kg)組于缺血再灌注120min后左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期術(shù)壓(LVDP)、左室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)、最大下降速率(-dp/dtmax)顯著高于缺血再灌注組；缺血再灌注+Wy14643(0.5mg/kg)組于缺血再灌注120min后各項(xiàng)心功能指標(biāo)無(wú)明顯改善，與缺血再灌注組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 ②缺血再灌注+激動(dòng)劑Wy

11、14643組(1mg/kg、2mg/kg)心肌梗死面積分別為(50.8±7.2及51.4±4.2)較缺血再灌注組(78.2±5.5)顯著減少(P＜0.05)；而缺血再灌注+激動(dòng)劑Wy14643(0.5mg/kg)組心肌梗死面積分別為(76.4±4.1)，與缺血再灌注組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 ③與缺血再灌注組心肌PPARαmRNA(0.417±0.127)比較，加入Wy14643(0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/

12、kg)后各組心肌PPARαmRNA分別為0.960±0.142、1.481±0.311及2.120±0.363，亦顯著高于假手術(shù)組(0.711±0.156，P＜0.01)。④IR組細(xì)胞凋亡達(dá)47.4±3.3，而給予0.5mg/kgWy14643并未明顯改善IR的細(xì)胞凋亡率(細(xì)胞凋亡為40.2±6.1)，給予1mg/kg，2mg/kg的Wy14643可使細(xì)胞凋亡降至25.3±3.4及27.4±5.3。 結(jié)論：Wy14643使心肌中

13、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)顯著上調(diào)，并可顯著改善實(shí)驗(yàn)性大鼠缺血再灌注心肌心功能、減少梗死面積及心肌細(xì)胞凋亡。 第四部分PKC對(duì)培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞PPARα的調(diào)控 目的：研究培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞中PKC調(diào)控過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)轉(zhuǎn)錄活性機(jī)制。 方法：心肌細(xì)胞培養(yǎng)后，隨機(jī)分為四組：對(duì)照組，Wy14643組，Wy14643+不同濃度的PKC的抑制劑CHE(25，50nmol/L)

14、組。Wy14643組加入Wy14643(終濃度150μmol/L)溫育40min;Wy14643+CHE組在加入Wy14643前1h，加入CHE，終濃度為25、50nmol/L的CHE于培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)用半定量RT-PCR方法檢測(cè)培養(yǎng)心肌細(xì)胞中PPARαmRNA的表達(dá)，并運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PPARα蛋白表達(dá)情況。對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：PPARαmRNA水平在Wy14643作用后顯著升高，與對(duì)

15、照組比較差異有顯著意義(2.615±0.412vs0.741±0.135，P＜0.05)，而對(duì)Wy14643組預(yù)先給予PKC的抑制劑CHE(終濃度為25nmol/L)，則PPARαmRNA表達(dá)水平降為1.702±0.317較單純Wy14643作用組明顯降低，若將PKC的抑制劑CHE的終濃度升至50nmol/L，PPARαmRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降至1.145±0.233。正常體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)為11.58±1.2

16、7;給予Wy14643可使PPARα的轉(zhuǎn)錄活性提高近3倍(38.11±2.79)；但是若預(yù)先給予PKC的抑制劑CHE則可以不同程度的阻止Wy14643的這種作用，表現(xiàn)為：Wy14643+25nmol/LCHE使心肌細(xì)胞PPARα蛋白表達(dá)降低至21.42±2.83，加大CHE至50nmol/L則使PARα及蛋白進(jìn)一步降低至15.61±2.27。 結(jié)論：Wy14643組心肌PPARαmRNA及蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)。使用PKC抑制劑C