酪氨酸酶途徑的多巴胺能系統(tǒng)在豚鼠屈光發(fā)育中的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 酪氨酸酶途徑多巴胺代謝異常促進(jìn)了豚鼠屈光發(fā)育的近視偏移
　　目的:多巴胺是參與眼球生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的神經(jīng)遞質(zhì)之一。眼內(nèi)多巴胺主要來(lái)源于視網(wǎng)膜神經(jīng)層的酪氨酸羥化酶源性的多巴胺和視網(wǎng)膜RPE及脈絡(luò)膜復(fù)合體中的酪氨酸酶源性的多巴胺。既往對(duì)酪氨酸羥化酶源性的多巴胺研究較多，但對(duì)酪氨酸酶源性的多巴胺是否在眼發(fā)育以及正視化中存在作用，尚未明確。本研究將探討酪氨酸酶源性的多巴胺能系統(tǒng)在眼屈光發(fā)育

2、中的作用。
　　方法:選擇兩周齡的白化近視和有色遠(yuǎn)視的豚鼠，測(cè)量其屈光度后分兩部分，其中15只（白化:n=7，-8.25±1.40D;有色:n=8，+6.50±0.93D）動(dòng)物用于測(cè)量玻璃體、視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織中多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平，36只豚鼠（白化:n=18，-7.54±3.26D;有色:n=18，+1.20±5.94D）用于測(cè)量脈絡(luò)膜中酪氨酸酶的活性。第三部分實(shí)驗(yàn)選用兩周齡的有色遠(yuǎn)視的豚鼠，測(cè)量其屈光度及眼軸長(zhǎng)度之后每天半

3、球后注射酪氨酸酶抑制劑-曲酸（0ng組:n=8;62.5ng組:n=30;625ng組:n=19;6250ng組:n=9），連續(xù)注射兩周后再次測(cè)量其屈光狀態(tài)及眼軸長(zhǎng)，記錄視網(wǎng)膜閃光ERG后取其脈絡(luò)膜組織測(cè)量酪氨酸酶活性，分析酪氨酸酶活性的抑制程度與屈光發(fā)育的相關(guān)性;在62.5ng組注射兩周后，有16只豚鼠繼續(xù)接受半球后注射62.5ng的曲酸(n=16)，9只豚鼠則增加注射曲酸的濃度，繼續(xù)注射625ng的曲酸(n=9)，再持續(xù)兩周;紅外偏

4、心攝影驗(yàn)光儀測(cè)量眼屈光;11Hz的A型超聲檢測(cè)儀測(cè)量玻璃體腔深度及眼軸長(zhǎng)度等參數(shù);高效液相電化學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)多巴胺及其代謝產(chǎn)物;改良的MBTH停止反應(yīng)法檢測(cè)酪氨酸酶活性。
　　結(jié)果:白化豚鼠視網(wǎng)膜的多巴胺水平及其代謝產(chǎn)物與有色豚鼠比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;白化豚鼠玻璃體中的多巴胺代謝產(chǎn)物多巴克的量顯著高于有色豚鼠（白化:68.24±17.04ug/g玻璃體組織;有色:52.17±7.10ug/g玻璃體組織;p＜0.05），但是另一種代謝產(chǎn)

5、物高香草酸的含量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示白化豚鼠視網(wǎng)膜的多巴胺能系統(tǒng)與有色豚鼠比較無(wú)顯著性差異;脈絡(luò)膜中多巴胺的水平有色豚鼠顯著高于白化豚鼠（有色:66.96±51.01ug/g脈絡(luò)膜組織;白化:10.56±7.15ug/g脈絡(luò)膜組織;p＜0.01），但是其代謝產(chǎn)物的量卻顯著低于白化豚鼠（有色vs白化，多巴克:117.8±31.98 vs150±31.3ug/g脈絡(luò)膜組織，p＜0.05;高香草酸:18.6±4.44 vs27.2±6.42u

6、g/g脈絡(luò)膜組織，p＜0.01）;對(duì)脈絡(luò)膜組織中酪氨酸酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)白化豚鼠脈絡(luò)膜組織中酪氨酸酶的活性并不是零，但是如預(yù)期顯著低于有色豚鼠（有色vs白化，2.31±1.10 vs0.21±0.20吸光度值/mg蛋白，p＜0.001），提示白化豚鼠脈絡(luò)膜組織中的多巴胺能系統(tǒng)存在異常。
　　提取脈絡(luò)膜組織中的酪氨酸酶，與曲酸混合一小時(shí)時(shí)其活性呈現(xiàn)劑量依賴性的被曲酸所抑制;與曲酸混合24小時(shí)后，62.5ng組酶活性有一個(gè)反彈趨勢(shì)

7、，較空白對(duì)照組的酶活性還高，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在體實(shí)驗(yàn)顯示藥物處理兩周后酪氨酸酶抑制劑曲酸能誘導(dǎo)有色豚鼠的屈光發(fā)育向近視方向偏移（溶劑組vs62.5ng vs625ng vs6250ng:實(shí)驗(yàn)眼與對(duì)側(cè)眼的屈光度差值，-0.38±0.17D vs-1.61±0.23D vs-2.17±0.28D vs-1.92±0.44D，p＜0.01;玻璃體腔的差值，0.009±0.007mm vs0.022±0.01mm vs0.033±0.012

8、mm vs0.043±0.011mm,p＜0.05，單因素方差分析）;相應(yīng)的，注藥后的脈絡(luò)膜組織中酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)酪氨酸酶活性被抑制時(shí)可以誘導(dǎo)出有效的近視偏移，當(dāng)酪氨酸酶活性不能有效抑制時(shí)，則誘導(dǎo)近視偏移失敗(相應(yīng)線性方差為:近視偏移量=2.88*酶活抑制率-0.58，R2=0.62)。當(dāng)對(duì)62.5ng組的豚鼠以不同劑量延長(zhǎng)注射時(shí)間的結(jié)果顯示，繼續(xù)注射62.5ng組近視偏移量沒(méi)有相應(yīng)增加，而增加藥物劑量至625ng組近視偏移量繼續(xù)增加

9、。
　　結(jié)論:近視白化豚鼠的視網(wǎng)膜色素上皮層(retinal pigmented epithelium，RPE)及脈絡(luò)膜復(fù)合體中的多巴胺水平和酪氨酸酶活性顯著低于遠(yuǎn)視有色豚鼠;干預(yù)有色豚鼠RPE及脈絡(luò)膜復(fù)合體中的酪氨酸酶活性可以誘導(dǎo)近視偏移。由此推測(cè)是酪氨酸酶活性降低影響了脈絡(luò)膜多巴胺的合成代謝，并且酪氨酸酶源性的多巴胺能系統(tǒng)也參與了眼屈光的發(fā)育與近視的偏移。
　　第二部分 酪氨酸酶途徑多巴胺功能降低致視網(wǎng)膜fERG反應(yīng)增高

10、促進(jìn)了豚鼠屈光發(fā)育的近視偏移
　　目的:因?yàn)椴煌亩喟桶纺苁荏w家族對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的作用相反，如D1樣受體激活腺苷酸環(huán)化酶的活性，而D2樣受體則抑制該酶的活性，進(jìn)而相反地影響著視網(wǎng)膜神經(jīng)元間的縫隙連接，表現(xiàn)為對(duì)光反應(yīng)的不同。本研究通過(guò)比較近視白化與遠(yuǎn)視有色豚鼠對(duì)相同閃爍光刺激的視網(wǎng)膜電生理反應(yīng)，結(jié)合藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)初步探索酪氨酸酶源性的多巴胺能系統(tǒng)對(duì)視網(wǎng)膜電生理的影響。
　　方法:對(duì)三周齡的近視白化和遠(yuǎn)視有色豚鼠，測(cè)量其視網(wǎng)膜電生

11、理反應(yīng)，其中一組進(jìn)行暗適應(yīng)（白化:n=26，-6.93±1.44D;有色:n=10，+4.63±1.43D）后記錄視網(wǎng)膜電生理反應(yīng)，另外一組進(jìn)行明適應(yīng)（白化:n=29，-6.71±1.49D;有色:n=14，+4.11±1.79D）后記錄視網(wǎng)膜電生理反應(yīng)。對(duì)藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)組連續(xù)注射兩周酪氨酸酶抑制劑后的有色豚鼠，記錄其視網(wǎng)膜閃光ERG;另外用三周齡的遠(yuǎn)視有色豚鼠(n=3)給予多巴胺D2受體激動(dòng)劑quinpirole，三周齡的近視白化豚鼠(

12、n=6)給予多巴胺D1受體激動(dòng)劑SKF38393，觀察給藥一小時(shí)后的視網(wǎng)膜閃光ERG的變化;閃光ERG用羅蘭電生理儀檢測(cè)。
　　結(jié)果:在暗適應(yīng)情況下的視網(wǎng)膜電生理反應(yīng)，白化豚鼠的a波在較強(qiáng)刺激強(qiáng)度時(shí)幅值高于有色豚鼠，但是b波反應(yīng)幅值在a波的未出現(xiàn)差異時(shí)已高于有色豚鼠，但是b波與a波的比值在白化和有色豚鼠之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在明適應(yīng)情況下，白化豚鼠的a波和b波的幅值在所有刺激強(qiáng)度均高于有色豚鼠，且a波和b波的比值也始終高于有色豚鼠(

13、p＜0.01，單因素方差分析)。提示白化豚鼠的光感受器細(xì)胞層的電反應(yīng)處于高敏感性，尤其是司明視覺(jué)的錐-雙極細(xì)胞通路。兩周的酪氨酸酶抑制劑的處理使視網(wǎng)膜閃光ERG呈高反應(yīng)性（在0db的刺激下，溶劑組vs藥物注射組:暗適應(yīng)時(shí)，1.49±0.08μV vs1.29±0.08μV;明適應(yīng)時(shí)，3.79±0.74μV vs10.23±3.52μV);多巴胺D2受體激動(dòng)劑quinpirole可以提高有色豚鼠視網(wǎng)膜外層的閃光ERG反應(yīng)(打藥組vs溶劑組

14、:22.8±22.6μV vs1.1±2.4μV)，而多巴胺D1受體激動(dòng)劑SKF38393似乎可以抑制白化豚鼠視網(wǎng)膜外層的閃光ERG反應(yīng)（打藥組vs溶劑組:0.1±1.5μV vs0.6±2.4μV）。
　　結(jié)論:近視白化豚鼠脈絡(luò)膜酪氨酸酶活性和多巴胺水平降低，外段視網(wǎng)膜閃光ERG在明適應(yīng)情況下較遠(yuǎn)視有色豚鼠的反應(yīng)高;當(dāng)有色豚鼠的RPE及脈絡(luò)膜復(fù)合體中的酪氨酸酶活性被抑制后，其視網(wǎng)膜閃光ERG的反應(yīng)在明適應(yīng)時(shí)也是呈增高趨勢(shì);多巴胺