用PCR法快速定量人類糞便中雙歧桿菌的研究.pdf

1、目的:人類腸道擁有大量活躍、復(fù)雜的菌群,其中約占正常成人腸道菌群3﹪,嬰兒腸道菌群75﹪-91﹪的雙歧桿菌是一種重要的維持腸道微生態(tài)平衡的生理菌,具有預(yù)防腹瀉與腸道感染、緩解便秘、免疫調(diào)節(jié)的作用,<'[1,2]>快速準(zhǔn)確定量人類糞便中的雙歧桿菌對(duì)于分析腸道復(fù)雜菌群的結(jié)構(gòu),配合臨床檢驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥,保持腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡,維持健康預(yù)防疾病具有重要意義.目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于腸道中雙歧桿菌的定量采用的對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行稀釋滴種法分離計(jì)數(shù),費(fèi)時(shí)費(fèi)力;在提取

2、DNA基礎(chǔ)上建立的普通PCR法只能定性和地定量,<'[3]>DNA提取步驟繁瑣且DNA提取中用到的酚、蛋白酶K等試劑易抑制PCR擴(kuò)增,<'[4]>影響雙歧桿菌的定量.該實(shí)驗(yàn)的目的是將糞便離心、洗滌處理后,不經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)和DNA提取純化步驟,用real-time PCR建立快速、準(zhǔn)確從糞便標(biāo)本中定量雙歧桿菌.方法:實(shí)驗(yàn)分為二部分:第一部分用普通PCR法定量人類糞便中雙歧桿菌.根據(jù)16SrRNA基因設(shè)計(jì)雙歧桿菌屬特異引物,將糞便離心、洗滌處

3、理后,不經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)和DNA提取純化步驟,用普通PCR法從糞便標(biāo)本中半定量雙歧桿菌.并且比較普通PCR定量的雙歧桿菌結(jié)果和傳統(tǒng)稀釋滴種法定量的雙歧桿菌結(jié)果的相關(guān)性.第二部分用real-time PCR法定量人類糞便中雙歧桿菌.利用相同的雙歧桿菌屬特異引物,將糞便離心、洗滌處理后,不經(jīng)過(guò)分離培養(yǎng)和DNA提取純化步驟,但經(jīng)過(guò)系列稀釋糞便后用real-time PCR定量雙歧桿菌.并且比較real-time PCR定量的雙歧桿菌結(jié)果和傳統(tǒng)稀釋