環(huán)維黃楊星D對大鼠在體回腸的作用及其機制研究.pdf

1、目的： 探討中藥單體環(huán)維黃楊星D（CVB-D）對大鼠在體回腸的作用，并進一步從細胞水平上探討其作用機制。 方法： 1.經(jīng)十二指腸插管給予不同濃度的CVB-D，利用BL-410生物機能實驗系統(tǒng)觀察CVB-D對大鼠在體回腸收縮幅度及頻率的影響，并預先給予鈣通道阻滯藥硝苯地平以初步推斷CVB-D對大鼠在體回腸的作用機制。 2.采用混合酶法（膠原酶、鏈霉蛋白酶E、牛血清白蛋白）分離培養(yǎng)大鼠回腸平滑肌細胞，繪制原代

2、培養(yǎng)的平滑肌細胞生長曲線，并利用平滑肌肌動蛋白α-actin免疫組織化學染色進行鑒定。 3.利用MTT比色法測定CVB-D對大鼠回腸平滑肌細胞增殖的影響，通過細胞培養(yǎng)液的LDH檢測CVB-D的細胞毒性。 4.應(yīng)用鈣敏感的熒光指示劑Fura-2，于熒光分光光度計上測定CVB-D作用后平滑肌細胞內(nèi)游離鈣離子濃度（[Ca2+]i），從細胞水平上探討CVB-D的作用機制。 結(jié)果： 1.與生理鹽水組比較，CVB-D

3、低、中、高劑量組在給藥110min后大鼠回腸的收縮幅度增強，且隨著時間延長收縮幅度升高更為顯著（P<0.05），并且各組藥物之間具有劑量依賴性；而預先給予鈣通道阻滯藥硝苯地平可拮抗其對回腸的收縮作用（P<0.05）； CVB-D對回腸的收縮頻率無顯著影響（P>0.05）。 2.新鮮分離的回腸平滑肌細胞呈長短不一的梭形或橢圓形，細胞培養(yǎng)48h后，可見細胞已貼壁，3～5d細胞開始增殖，10 d后細胞密集，呈峰谷樣生長，細胞長成致密單

4、層時即可傳代。免疫細胞化學檢測結(jié)果顯示：大部分多角形細胞胞漿內(nèi)見棕色及淺棕色細顆粒，呈陽性反應(yīng)，核不著色，呈淺藍色。可見培養(yǎng)的平滑肌細胞純度較高，幾無成纖維細胞混雜。 3.MTT測定顯示，低、中劑量CVB-D對平滑肌細胞有明顯的促進增殖作用（P<0.01），而高劑量CVB-D則抑制細胞的增殖（P<0.05）。細胞培養(yǎng)液的LDH檢測結(jié)果顯示，低、中劑量CVB-D組LDH明顯低于空白對照組（P<0.01），提示CVB-D對細胞有保護

5、作用，而高劑量組LDH明顯高于對照組（P<0.01），提示過高濃度CVB-D會對細胞造成損傷或促進凋亡。 4.當回腸平滑肌細胞懸液細胞外鈣（[Ca2+]o）為1.5mmol/L時，CVB-D可誘發(fā)靜息期[Ca2+]i升高，而預先給予維拉帕米可以抑制[Ca2+]i的升高，抑制率為17.9%；當[Ca2+]o為0mmol/L時，CVB-D仍可使[Ca2+]i升高，而普魯卡因?qū)Ca2+]i升高的抑制率達29.2%。 結(jié)論：