基于MAPKs和線粒體功能crosstalk的環(huán)維黃楊星D改善醛固酮誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立醛固酮（ALD）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡模型，研究MAPKs信號(hào)和線粒體功能在醛固酮介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡過程中的作用，進(jìn)一步研究環(huán)維黃楊星D（CVB-D）對(duì)醛固酮誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，探討CVB-D對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制，為CVB-D預(yù)防和治療心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:采用胰蛋白酶消化新生1-3 d SD大鼠心臟組織，差速貼壁法分離心肌細(xì)胞，培養(yǎng)前三天加入終濃度為0.1 mmol/L5-溴脫氧核苷抑制成纖維細(xì)胞的增

2、殖。使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在不同時(shí)間的形態(tài)學(xué)變化并拍照；特異性肌鈣蛋白（Cardiac Troponin T，c-TnT）免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定心肌細(xì)胞并計(jì)算純度。采用MTT法觀察不同濃度的ALD對(duì)心肌細(xì)胞影響，最終確定ALD10μM、作用時(shí)間36 h作為心肌細(xì)胞凋亡模型復(fù)制條件；CVB-D濃度設(shè)定為0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，預(yù)保護(hù)1 h，隨后使用ALD復(fù)制凋亡模型，最終確定CVB-D高、低劑量分別為10μM

3、和1μM。實(shí)驗(yàn)共分為5組：正常對(duì)照組（Control），模型組(ALD，10μM)，ALD+CVB-D高劑量組（CVB-D（H），10μM），ALD+CVB-D低劑量組（CVB-D（L），1μM），ALD+螺內(nèi)酯組（Spiro，10μM）。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率；LDH外漏檢測(cè)心肌細(xì)胞膜的完整性；Giemsa染色法和HE染色法從形態(tài)學(xué)上觀察各組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡情況，Western blo

4、t檢測(cè)各組p-P38、P38、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)水平。使用P38抑制劑（SB203580，10μmol/L）、JNK抑制劑（SP600125，5μmol/L）、線粒體mPTP孔抑制劑米酵菌酸（bongkrekic acid solution，BA，20μmol/L）探究MAPK信號(hào)通路與線粒體之間的crosstalk，Western blot檢測(cè)各組p-P38、P38、p-JNK、JNK蛋白表達(dá)水平，JC-1熒光染色檢測(cè)線粒體膜

5、電位變化。
　　結(jié)果：胰酶消化法得到的原代心肌細(xì)胞在培養(yǎng)48 h后細(xì)胞伸出偽足并出現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞或多個(gè)細(xì)胞的搏動(dòng)，培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞連接成片開始同步搏動(dòng)；對(duì)心肌細(xì)胞特異性蛋白c-TnT進(jìn)行免疫染色，其表達(dá)結(jié)果呈陽性，即胞漿中有深棕黃色顆粒出現(xiàn)，心肌細(xì)胞純度達(dá)到92%。ALD（10μM，36 h）作用心肌細(xì)胞后，OD490值降低（P＜0.01)，而LDH 外漏量升高(P＜0.05)；高、低劑量CVB-D（10μM，1μM）和

6、螺內(nèi)酯（10μM）處理之后經(jīng)MTT法測(cè)得的OD490值升高（P＜0.05或者P＜0.01)，LDH外漏量降低（P＜0.05或者P＜0.01)。HE和Giemsa染色法證實(shí)ALD可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生損傷（P＜0.01)，而CVB-D和螺內(nèi)酯可以改善ALD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷(P＜0.01)；流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，CVB-D和螺內(nèi)酯對(duì)ALD誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡具有顯著的抑制作用。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，ALD可誘導(dǎo)心肌

7、細(xì)胞p-P38、p-JNK蛋白表達(dá)上調(diào)，CVB-D和螺內(nèi)酯可不同程度下調(diào)其磷酸化表達(dá)。Western blot結(jié)果提示線粒體mPTP孔抑制劑可降低ALD誘導(dǎo)的p-P38和p-JNK表達(dá)增加，JC-1熒光染色顯示P38抑制劑及JNK抑制劑可逆轉(zhuǎn)ALD誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低。
　　結(jié)論：ALD可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與誘導(dǎo)心肌細(xì)胞p-P38和p-JNK蛋白表達(dá)上調(diào)，降低心肌細(xì)胞線粒體膜電位有關(guān)。MAPK信號(hào)通路與線粒體功能之間存在