艾滋病毒Tat對(duì)HHV-8 K12基因誘導(dǎo)腫瘤形成的影響及其分子機(jī)制初探.pdf

1、本研究的目的:是探索人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1，又稱艾滋病毒)反式激活轉(zhuǎn)錄蛋白(transactivative transcription protein，Tat)對(duì)人類皰疹病毒8型(human herpesvirus 8，HHV-8)K12基因誘導(dǎo)腫瘤形成的影響及其分子機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了含HHV-8 K12基因的重組質(zhì)粒K12-Flag-pcDN

2、A3.1(+)(命名為pK12F)，將其與本室保存Tat-Flag-pcDNA3.1(+)(命名為pTatF)質(zhì)粒單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞(Swiss小鼠成纖維細(xì)胞)，同時(shí)以空載體pcDNA3.1(+)為對(duì)照，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的四株細(xì)胞，分別命名為N/K12、N/Tat、N/K12/Tat、N/pcDNA3.1。進(jìn)而采用<'3>HTdR摻入實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞檢測(cè)法分別測(cè)定上述四株細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞周期。<'3>HTdR摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3、顯示，四株細(xì)胞的增殖能力從高到低依次為N/K12/Tat、N/K12、N/pcDNA3.1、N/Tat(P<0.05)；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，四株細(xì)胞的S期細(xì)胞比率(S-phase fraction，SPF)從高到低的排序與<'3>HTdR摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。隨后，軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)上述四株細(xì)胞均能體外誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。將四株細(xì)胞分別進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，自分泌和近距離旁分泌Tat蛋白能加速HHV-8 K12誘導(dǎo)腫瘤的形成(Log

4、-rank檢驗(yàn)，P<0.05)，遠(yuǎn)距離旁分泌Tat蛋白不具備此功能(P>0.05)。為進(jìn)一步探索Tat和K12相互作用的機(jī)制，采用基因芯片技術(shù)對(duì)這四株細(xì)胞及其對(duì)應(yīng)的腫瘤組織進(jìn)行了與腫瘤形成相關(guān)15條信號(hào)通路96個(gè)標(biāo)志物基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然細(xì)胞和組織結(jié)果存在差異，但均顯示出Tat能促使K12基因激活更多的腫瘤信號(hào)基因。Western blot檢測(cè)四株細(xì)胞中STAT3(signal transducer and activa

5、tor of transcription 3，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3)蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示Tat可以促進(jìn)K12激活磷酸化STAT3的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)裸鼠腫瘤組織中CyclinD1(周期蛋白D1)、VEGF(vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)和Survivin(存活素)的結(jié)果表明Tat能降低這些蛋白在K12誘導(dǎo)的腫瘤中的表達(dá)。 本研究結(jié)果提示，在體外Tat能增強(qiáng)K