艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞的體內(nèi)分布及關(guān)鍵抑制因素研究.pdf

1、艾滋病，又稱獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，是人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的危害極大的感染性疾病。截止目前，全球仍有3900萬(wàn)HIV感染者，占全球人口的5.4‰，是現(xiàn)代歷史上最嚴(yán)重的傳染性疾病之一。高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)是目前對(duì)抗HIV感染的主要武器，能有效降低HIV感染者的病毒載量，延緩艾滋病發(fā)生，延長(zhǎng)感染者壽命。但HAART不能使感染者免疫功能完全恢復(fù)正常，也不能徹底清除機(jī)體內(nèi)HIV病毒，停藥后病毒載量迅速反彈。

2、研究表明，病毒控制人群的反彈病毒來(lái)自宿主體內(nèi)重新激活的病毒潛伏感染細(xì)胞?？蒲腥藛T早已證實(shí)了HIV潛伏感染細(xì)胞的存在;而且現(xiàn)有高效HAART治療也不能完全清除體內(nèi)HIV潛伏感染細(xì)胞。因此，HIV潛伏感染細(xì)胞被認(rèn)為是HIV感染治愈的主要障礙。
　　為實(shí)現(xiàn)HIV感染的治愈，科研人員探索了多種HIV潛伏感染細(xì)胞的清除策略，如模擬“密西西比嬰兒”的早期治療策略，模擬“柏林病人”的骨髓移植策略，直接靶向病毒潛伏感染細(xì)胞的激活與清除策略以及增強(qiáng)

3、機(jī)體抗病毒免疫的免疫抑制策略等，但上述策略的臨床效果及適用性均不夠理想;提示仍需要對(duì)病毒潛伏感染細(xì)胞及其影響因素進(jìn)行深入的研究，特別是尚未突破的幾個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題:一、艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞的體內(nèi)分布;二、抑制艾滋病毒反彈的關(guān)鍵因素。針對(duì)這兩關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，本研究通過(guò)基于流式細(xì)胞術(shù)的病毒潛伏感染細(xì)胞檢測(cè)策略的建立，檢測(cè)艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞的體內(nèi)分布;同時(shí)，探尋艾滋病毒自然抑制模型中病毒有效控制的關(guān)鍵因素，深入研究艾滋病毒儲(chǔ)存庫(kù)分布和抑制的關(guān)鍵

4、機(jī)制，為HIV感染的治療策略研發(fā)提供研究思路與理論依據(jù)。
　　第一部分 艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞的體內(nèi)分布研究
　　清除艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞的首要任務(wù)是確定該細(xì)胞在體內(nèi)分布情況。鑒于艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞生物學(xué)上的特殊性，本研究首先建立了一種新型的艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞的檢測(cè)策略。通過(guò)比較SIV p27/gp41抗體細(xì)胞表面染色和SmartFlare技術(shù)在艾滋病毒復(fù)制陰性細(xì)胞分選中的優(yōu)劣，比較CD3/CD28免疫磁珠、LPS與PHA

5、在免疫細(xì)胞激活的差別，比較SIV p27抗體細(xì)胞內(nèi)染色法和FlowRNA技術(shù)在病毒潛伏感染細(xì)胞分析中的優(yōu)缺點(diǎn);分別選擇SmartFlare技術(shù)、CD3/CD28免疫磁珠/LPS和FlowRNA技術(shù)用于后續(xù)研究，同時(shí)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立基于流式細(xì)胞術(shù)的艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞檢測(cè)策略(FlowVLIC)。比較發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)策略檢測(cè)的病毒潛伏感染細(xì)胞規(guī)模位于QVOA法和前病毒DNA-PCR法的檢測(cè)結(jié)果之間，更符合艾滋病毒儲(chǔ)存庫(kù)的理論規(guī)模。之后，本研究

6、使用該檢測(cè)策略檢了RT-SHIV/恒河猴病毒抑制模型病毒潛伏感染細(xì)胞的組織、細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)其病毒潛伏感染細(xì)胞主要分布于淋巴組織、腸道黏膜等部位，細(xì)胞類型以記憶性CD4+細(xì)胞為主。進(jìn)一步，本研究還分析了不同部位、不同細(xì)胞來(lái)源潛伏病毒env、rt基因序列，發(fā)現(xiàn)潛伏病毒的整合位點(diǎn)與細(xì)胞類型存在一定的相關(guān)性，需進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。本研究首次初步確定了艾滋病毒潛伏感染細(xì)胞在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型體內(nèi)的組織、細(xì)胞分布。
　　第二部分 艾滋病毒自

7、然抑制的關(guān)鍵因素研究
　　為達(dá)到HIV功能性治愈，即在不施以抗病毒治療的前提下，機(jī)體也能有效的控制機(jī)體內(nèi)的病毒復(fù)制，探尋病毒抑制的關(guān)鍵因素至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)室前期使用SIV、SHIV病毒小劑量多次黏膜接種恒河猴，可高效誘導(dǎo)病毒自然抑制現(xiàn)象，類似于臨床的精英控制者，但其原因未知。本研究首先通過(guò)猴免疫缺陷病毒(SIVmac239)病毒小劑量多次直腸接種恒河猴建立病毒自然抑制模型，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組，然后從細(xì)胞免疫、體液免疫和固有免疫等多

8、個(gè)角度探尋病毒抑制的免疫機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒抑制動(dòng)物的細(xì)胞免疫和體液免疫未見明顯升高，甚至低于正常對(duì)照組;但兩組動(dòng)物固有免疫反應(yīng)存在明顯的差異，病毒抑制組高于正常對(duì)照組，提示固有免疫反應(yīng)在病毒自然抑制現(xiàn)象中發(fā)揮一定的作用。此外，本研究還探尋了病毒靶細(xì)胞和固有抗病毒因子在該現(xiàn)象中發(fā)揮的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組動(dòng)物不同組織的靶細(xì)胞數(shù)量和固有抗病毒因子表達(dá)和變異上沒(méi)有明顯差異。最后，本研究從感染病毒角度進(jìn)行了探索，通過(guò)SGA方法獲得了模型感染的奠基者

9、(T/F)病毒，分析T/F病毒數(shù)量和適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)病毒抑制動(dòng)物的T/F病毒數(shù)量顯著少于正常對(duì)照動(dòng)物，而且感染病毒適應(yīng)性也明顯弱于正常對(duì)照動(dòng)物?；谏鲜鼋Y(jié)果，提示機(jī)體的固有免疫反應(yīng)和感染病毒特性在艾滋病毒自然抑制方面具有重要影響，后續(xù)在HIV感染治愈策略研究中需要考慮這些因素。
　　綜上所述，本研究通過(guò)建立基于流式細(xì)胞術(shù)的病毒潛伏感染細(xì)胞檢測(cè)策略，確定了恒河猴模型體內(nèi)的病毒潛伏感染細(xì)胞分布;建立的檢測(cè)方法也可用于后續(xù)HIV感染治療策略