新生神經(jīng)元異常融入齒狀回神經(jīng)環(huán)路介導(dǎo)卒中后癲癇發(fā)生.pdf

1、背景:癲癇是腦卒中后常見(jiàn)的并發(fā)癥。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)腦卒中后癲癇的發(fā)病率超過(guò)10％，占新確診的成年癲癇患者的三分之一；60歲以上新診斷的癲癇患者中，近一半與腦血管病有關(guān)。隨著生活質(zhì)量和醫(yī)療水平的提高，腦卒中患者存活期延長(zhǎng)，腦卒中后癲癇的患病率也隨之增加。然而，目前仍然缺乏腦卒中后癲癇有效防治辦法，對(duì)其發(fā)生機(jī)制也不甚了解。成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)神經(jīng)祖細(xì)胞主要位于海馬齒狀回顆粒下層和側(cè)腦室的室下區(qū)，它們能夠增殖分化成為神經(jīng)元。在新生神經(jīng)元的發(fā)育過(guò)程

2、中，它們逐漸伸出軸突和樹(shù)突，與周圍的細(xì)胞形成功能性突觸聯(lián)系并整合到原有的神經(jīng)環(huán)路中，發(fā)揮相應(yīng)的作用。神經(jīng)發(fā)生過(guò)程受多種因素影響。有研究表明腦卒中的新生大鼠成年后認(rèn)知功能障礙、呈現(xiàn)高度興奮狀態(tài)并伴有癲癇發(fā)生。還有報(bào)道指出，腦卒中促進(jìn)海馬神經(jīng)祖細(xì)胞活化增殖，新生細(xì)胞向損傷部位遷移，參與神經(jīng)功能修復(fù)；腦卒中或癲癇后，海馬新生神經(jīng)元形態(tài)和分布異常。卒中后新生神經(jīng)元的異常是否與癲癇的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，至今仍是一個(gè)謎。
　　目的:觀察缺血性腦卒中

3、小鼠齒狀回新生神經(jīng)元的形態(tài)和功能以及與癲癇發(fā)生的關(guān)系。
　　方法:通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞（MCAO）構(gòu)建4月齡小鼠腦缺血模型或相應(yīng)的假手術(shù)對(duì)照，本實(shí)驗(yàn)分別采用了雄性C57BL/6J小鼠、Nestin-Cre小鼠、ChR2小鼠、TeTX小鼠為研究對(duì)象。通過(guò)磁共振（MRI）和Fluoro-Jade C染色檢測(cè)小鼠卒中后腦部受損情況；采用逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV-EGFP）、腺相關(guān)病毒（AAV-EGFP）和狂犬病毒（ΔRabies-mCherry）

4、感染以及熒光染料顯微注射標(biāo)記新生神經(jīng)元；使用BrdU染色標(biāo)記新生細(xì)胞；利用RT-PCR方法檢測(cè)中間神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的GAD67、GFAP和Calbindin-D28K的mRNA表達(dá)水平；通過(guò)全細(xì)胞膜片鉗電生理技術(shù)記錄新生顆粒神經(jīng)元與原有顆粒神經(jīng)元的電生理特征；通過(guò)紅藻酸氨（KA）誘發(fā)急性癲癇發(fā)作；通過(guò)視頻腦電圖監(jiān)測(cè)小鼠的癲癇發(fā)作情況。
　　結(jié)果:MCAO小鼠反復(fù)自發(fā)癲癇發(fā)作。4月齡雄性C57BL/6小鼠行MCAO（C57

5、-MCAO小鼠）或假手術(shù)（C57-sham小鼠）處理，術(shù)后連續(xù)3個(gè)月記錄腦電圖和癲癇相關(guān)行為，結(jié)果顯示C57-MCAO小鼠術(shù)后1月左右開(kāi)始出現(xiàn)反復(fù)自發(fā)癲癇發(fā)作現(xiàn)象并伴有腦電圖異常。
　　MCAO小鼠海馬新生神經(jīng)元形態(tài)異常。4月齡雄性C57BL/6小鼠行MCAO（C57-MCAO小鼠）或假手術(shù)（C57-sham小鼠）處理，海馬齒狀回注射逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV-EGFP）標(biāo)記新生神經(jīng)元。2周及4周后，觀察新生神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)，結(jié)果顯示C57

6、-MCAO小鼠術(shù)后GFP+細(xì)胞數(shù)量顯著增加，雙極細(xì)胞所占比例增加，并出現(xiàn)多個(gè)基樹(shù)突。
　　MCAO小鼠海馬新生神經(jīng)元突觸連接異常。方法一：4月齡雄性C57BL/6小鼠行MCAO（C57-MCAO小鼠）或假手術(shù)（C57-sham小鼠）處理，海馬齒狀回注射逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV-EGFP）標(biāo)記新生神經(jīng)元，術(shù)后4周取動(dòng)物腦片，分別對(duì)GFP+細(xì)胞和GFP-細(xì)胞顯微注射綠色和紅色生物素染料，發(fā)現(xiàn)C57-MCAO小鼠GFP+細(xì)胞軸突纖維深入到分子層

7、。方法二：4月齡雄性C57BL/6小鼠行MCAO（C57-MCAO小鼠）或假手術(shù)（C57-sham小鼠）處理，腹腔注射BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞，海馬齒狀回注射AAV-EGFP標(biāo)記所有神經(jīng)元，3周后同樣的部位注射ΔRabies-mCherry標(biāo)記已被AAV感染的神經(jīng)元及其上級(jí)神經(jīng)元，此后1周取腦片觀察齒狀回EGFP+/mCherry+、EGFP+/mCherry-和EGFP-/mCherry+細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)和分布，與BrdU是否共定位，結(jié)果

8、顯示大部分EGFP-/mCherry+細(xì)胞是BrdU+細(xì)胞。
　　MCAO小鼠海馬新生神經(jīng)元異常融入齒狀回神經(jīng)環(huán)路。方法一：4月齡雄性Nes-Cre小鼠行MCAO手術(shù)（Nes-Cre-MCAO小鼠）或假手術(shù)（Nes-Cre-sham小鼠），術(shù)后1周海馬齒狀回注射腺相關(guān)病毒（AAV-ChR2-EGFP），同時(shí)連續(xù)5天腹腔注射BrdU；術(shù)后4周，進(jìn)行NeuN和BrdU染色，觀察兩組動(dòng)物海馬GFP+/NeuN+細(xì)胞和GFP+/NeuN+

9、/BrdU+細(xì)胞的數(shù)量、形態(tài)、分布以及NeuN+/BrdU+細(xì)胞占總GFP+細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示Nes-Cre-MCAO小鼠較Nes-Cre-sham小鼠新生神經(jīng)元數(shù)量增加，兩組動(dòng)物NeuN+/BrdU+細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯變化。方法二：4月齡雄性ChR2小鼠行MCAO手術(shù)（ChR2-MCAO小鼠）或假手術(shù)（ChR2-sham小鼠），并給予他莫昔芬（TAM）誘導(dǎo)表達(dá)ChR2和EGFP，術(shù)后4周取腦片記錄DG區(qū)ChR2+/EGFP+細(xì)胞與CA

10、3區(qū)以及DG區(qū)的ChR2-/EGFP-細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系，結(jié)果顯示ChR2-MCAO小鼠與ChR2-sham小鼠CA3區(qū)ChR2-/EGFP-細(xì)胞均可以記錄到EPSCs，ChR2-MCAO組小鼠DG區(qū)ChR2-/EGFP-細(xì)胞可以記錄到EPSCs，而在ChR2-sham組小鼠則記錄不到DG區(qū)ChR2-/EGFP-細(xì)胞的EPSCs。
　　MCAO小鼠海馬新生神經(jīng)元與原有成熟顆粒細(xì)胞形成功能性突觸連接。ChR2小鼠持續(xù)給予TAM，行M

11、CAO（ChR2+-MCAO小鼠）或假手術(shù)（ChR2+-sham小鼠），術(shù)后4周，取腦片記錄DG區(qū)ChR2+/EGFP+細(xì)胞與CA3區(qū)以及DG區(qū)的ChR2-/EGFP-細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系。結(jié)果顯示ChR2+-MCAO組小鼠和ChR2+-sham小鼠CA3區(qū)ChR2-/EGFP-細(xì)胞以及ChR2-MCAO組小鼠DG區(qū)ChR2-/EGFP-細(xì)胞可以記錄到EPSCs；該EPSCs與藍(lán)光光強(qiáng)呈線性正相關(guān)，對(duì)AMPA受體拮抗劑敏感。
　　小

12、鼠海馬新生神經(jīng)元中特異性表達(dá)TeTX可特異性阻斷其異常突觸傳遞，并不影響MCAO小鼠新生神經(jīng)元存活和電生理特征。4月齡雄性TeTX小鼠行MCAO處理（TeTX-MCAO小鼠），一組動(dòng)物給予TAM誘導(dǎo)新生神經(jīng)元中表達(dá)TeTX（TeTX+-MCAO小鼠），另外一組動(dòng)物給予正常對(duì)照溶劑（TeTX--MCAO小鼠），4周后，使用Fluoro-Jade C染色了解TeTX對(duì)細(xì)胞存活的影響，結(jié)果表明兩組動(dòng)物F-J+細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯差異；進(jìn)一步使用電

13、生理記錄兩組動(dòng)物GFP+和GFP-細(xì)胞的EPSCs和IPSCs，結(jié)果顯示兩組動(dòng)物的GFP+和GFP-細(xì)胞的EPSCs之間以及GFP+和GFP-細(xì)胞的IPSCs之間沒(méi)有明顯差異。TeTX小鼠行MCAO（TeTX-MCAO小鼠），術(shù)后1周海馬齒狀回注射腺相關(guān)病毒（AAV-ChR2），4周后，兩組動(dòng)物分別給予多西環(huán)素（DOX）（TeTX+-ChR2+-MCAO-mice）和正常對(duì)照溶劑（vehicle）(TeTX--ChR2+-MCAO-mi

14、ce)1周，然后第一次記錄光刺激新生神經(jīng)元和電刺激苔蘚纖維時(shí)CA3區(qū)和DG區(qū)的EPSCsNMDA，然后兩組全部更換為正常飲水1周，進(jìn)行第二次記錄（同第一次記錄）。結(jié)果顯示，TeTX--ChR2+-MCAO小鼠可以在CA3區(qū)和DG區(qū)記錄到光刺激和電刺激后的EPSCsNMDA，TeTX+-ChR2+-MCAO小鼠只能在CA3區(qū)記錄到電刺激后的EPSCsNMDA。
　　特異性阻斷海馬新生神經(jīng)元突觸傳遞能降低MCAO小鼠癲癇發(fā)作的頻率和強(qiáng)

15、度。4月齡雄性TeTX小鼠行MCAO（TeTX-MCAO小鼠）或假手術(shù)（TeTX-sham小鼠）處理，3周后開(kāi)始持續(xù)給予多西環(huán)素（TeTX+-MCAO/sham小鼠）或?qū)φ杖軇═eTX--MCAO/sham小鼠），1周后，開(kāi)始連續(xù)觀察腦電圖和行為學(xué)變化。結(jié)果顯示TeTX-sham小鼠無(wú)癲癇發(fā)生；TeTX--MCAO小鼠癲癇有發(fā)作，并且隨著腦缺血恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)其發(fā)作次數(shù)增加；TeTX+-MCAO小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和單次發(fā)作持續(xù)時(shí)間較TeT

16、X--MCAO小鼠低。也將4月齡雄性TeTX小鼠持續(xù)給予多西環(huán)素（TeTX+小鼠）或?qū)φ杖軇═eTX-小鼠），再行MCAO（TeTX+/--MCAO小鼠）或假手術(shù)（TeTX+/--sham小鼠）處理，給予10-30mg/kg的紅藻氨酸（KA）腹腔注射誘發(fā)急性癲癇發(fā)作，觀察注射KA后各組動(dòng)物腦電圖、癲癇發(fā)作情況以及死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著KA劑量的增加，各組動(dòng)物死亡率增加，以TeTX--MCAO小鼠居多；TeTX+/--sham小鼠和TeT

17、X+-MCAO小鼠腦電圖基本正常；TeTX--MCAO小鼠腦電圖波形出現(xiàn)明顯異常，癲癇指數(shù)高于其他組小鼠。進(jìn)一步使用 TeTX小鼠行MCAO（TeTX-MCAO小鼠）或假手術(shù)（TeTX-sham小鼠），術(shù)后4周開(kāi)始持續(xù)記錄兩組動(dòng)物（TeTX--MCAO/sham小鼠）癲癇發(fā)作情況4周（第一次記錄，R1），然后兩組動(dòng)物持續(xù)5周給予多西環(huán)素，記錄后四周兩組動(dòng)物（TeTX+-MCAO/sham小鼠）癲癇發(fā)作情況（第二次記錄，R2），然后兩組動(dòng)

18、物持續(xù)5周給予正常飲水，記錄后四周兩組動(dòng)物（TeTX--MCAO/sham小鼠）癲癇發(fā)作情況（第三次記錄，R3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，TeTX+/--sham小鼠幾乎沒(méi)有癲癇發(fā)作；對(duì)于TeTX-MCAO小鼠，R1時(shí)，其癲癇發(fā)作強(qiáng)度頻率均明顯高于假手術(shù)組小鼠，R2時(shí)，癲癇發(fā)作強(qiáng)度頻率較R1有明顯下降，R3時(shí)，癲癇發(fā)作強(qiáng)度頻率恢復(fù)到R1時(shí)的水平。
　　結(jié)論:新生神經(jīng)元異常整合到原有的神經(jīng)環(huán)路是卒中后癲癇反復(fù)發(fā)作的細(xì)胞基礎(chǔ)，阻斷該異