不同品系小鼠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性白色念珠菌性角膜炎的研究.pdf

1、目的：真菌性角膜炎(Fungal Keratitis，F(xiàn)K)是一種致盲率極高的感染性角膜病，其發(fā)病機(jī)理尚未明確。本研究主要選用兩種常見的小鼠品系Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠建立實(shí)驗(yàn)性真菌性角膜炎模型，通過比較兩種小鼠在發(fā)病及轉(zhuǎn)歸過程中的表現(xiàn)及各相關(guān)分子的變化水平，進(jìn)而研究真菌性角膜炎發(fā)病的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法：選用相同周齡雄性Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠，采用角膜基質(zhì)注射法注射1×108CFU/ml白色念珠菌孢

2、子1ul建立小鼠的真菌性角膜炎模型。從感染后第1天起每隔1天裂隙燈下觀察、采集圖片，并進(jìn)行臨床評(píng)分。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集血漿和受染角膜，組織病理學(xué)檢查受染角膜組織中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及真菌的生長(zhǎng)情況，真菌負(fù)荷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)受染角膜組織中真菌孢子含量(載菌量)，酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血漿和受染角膜勻漿液中IL-17、IFN-γ的含量，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)受染角膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子(MMPs，TIMPs)和膠原纖維等

3、分子基因表達(dá)水平的變化，免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證感染后第1天受染角膜內(nèi)IL-17分子的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：兩種品系的小鼠在角膜基質(zhì)注射1×105白色念珠菌孢子后均感染了嚴(yán)重的角膜炎。在感染早期，小鼠角膜水腫、潰瘍，后期病情減退。但相比于Balb/c小鼠，C57BL/6小鼠誘導(dǎo)CaK后在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)的平均疾病分?jǐn)?shù)更高(P<0.05)；且在感染后期Balb/c小鼠受染角膜逐漸恢復(fù)透明性，趨于正常狀態(tài)；而C57BL/6小鼠直至第30天仍可

4、見較大的角膜斑翳。角膜組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示C57BL/6小鼠的白念菌性角膜炎直至感染后的第14天仍有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，基質(zhì)層機(jī)化仍很明顯，而相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)Balb/c小鼠角膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)量已明顯減少(P<0.05)，基質(zhì)層細(xì)胞數(shù)有所減少，角膜厚度趨于正常。真菌負(fù)荷檢測(cè)結(jié)果顯示兩種品系小鼠受染角膜真菌負(fù)荷數(shù)隨著天數(shù)的推移呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，至感染后第10天，真菌負(fù)荷數(shù)趨于0。但C57BL/6小鼠在相應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)角膜組織菌落計(jì)數(shù)都較Balb

5、/c小鼠多(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示感染早期兩種品系小鼠血漿及受染角膜組織中均有較高水平IL-17的表達(dá)，中后期IL-17的表達(dá)下降，IFN-γ的表達(dá)量則明顯升高。感染早期，C57BL/6小鼠血漿及受染角膜組織中IL-17的表達(dá)量均明顯高于Balb/c小鼠(P<0.05)；而在感染中后期C57小鼠血漿及受染角膜組織中IFN-γ的表達(dá)量明顯低于Balb/c小鼠(P<0.05)。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了ELISA的檢測(cè)結(jié)果，即

6、在白色念珠菌性角膜炎早期(24h)，受染角膜便可檢測(cè)到大量的IL-17，且C57BL/6小鼠角膜內(nèi)IL-17的表達(dá)明顯多于Balb/c小鼠。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種品系小鼠受染角膜組織中大多數(shù)基因表達(dá)水平存在動(dòng)態(tài)變化，MMP-8，MMP-9，TIMP-1于感染后的第3天迅速升高并達(dá)到高峰，這一現(xiàn)象在兩種品系小鼠的檢測(cè)結(jié)果中都可以觀察到，但在C57BL/6小鼠角膜內(nèi)這三個(gè)因子的表達(dá)量明顯高于Balb/c小鼠(P<0.05)；TIMP-

7、2、Co13a1及Co14a1的表達(dá)略有增高，其中Balb/c小鼠受染角膜內(nèi)Co13a1和Co14a1的表達(dá)量明顯高于C57BL/6小鼠(P<0.05)；Cak的中期，可見Co13a1和Co14a1的表達(dá)量繼續(xù)升高并達(dá)到高峰，且Balb/c小鼠依然明顯高于C57BL/6小鼠(P<0.05)，MMP-2、MMP-13和TIMP-2緩慢升高，而MMP-8，MMP-9及TIMP-1的表達(dá)量則明顯下降(P<0.05)；后期，除了MMP-2、MM