不同品系小鼠誘導實驗性白色念珠菌性角膜炎的研究.pdf

1、目的：真菌性角膜炎(Fungal Keratitis，F(xiàn)K)是一種致盲率極高的感染性角膜病，其發(fā)病機理尚未明確。本研究主要選用兩種常見的小鼠品系Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠建立實驗性真菌性角膜炎模型，通過比較兩種小鼠在發(fā)病及轉(zhuǎn)歸過程中的表現(xiàn)及各相關(guān)分子的變化水平，進而研究真菌性角膜炎發(fā)病的相關(guān)機制。
　　 方法：選用相同周齡雄性Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠，采用角膜基質(zhì)注射法注射1×108CFU/ml白色念珠菌孢

2、子1ul建立小鼠的真菌性角膜炎模型。從感染后第1天起每隔1天裂隙燈下觀察、采集圖片，并進行臨床評分。在感染后的不同時間點收集血漿和受染角膜，組織病理學檢查受染角膜組織中炎性細胞的浸潤及真菌的生長情況，真菌負荷實驗檢測受染角膜組織中真菌孢子含量(載菌量)，酶聯(lián)免疫吸附劑測定實驗(ELISA)檢測血漿和受染角膜勻漿液中IL-17、IFN-γ的含量，實時定量PCR檢測受染角膜組織中基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子(MMPs，TIMPs)和膠原纖維等

3、分子基因表達水平的變化，免疫熒光技術(shù)驗證感染后第1天受染角膜內(nèi)IL-17分子的表達情況。
　　 結(jié)果：兩種品系的小鼠在角膜基質(zhì)注射1×105白色念珠菌孢子后均感染了嚴重的角膜炎。在感染早期，小鼠角膜水腫、潰瘍，后期病情減退。但相比于Balb/c小鼠，C57BL/6小鼠誘導CaK后在相應各時間點的平均疾病分數(shù)更高(P<0.05)；且在感染后期Balb/c小鼠受染角膜逐漸恢復透明性，趨于正常狀態(tài)；而C57BL/6小鼠直至第30天仍可

4、見較大的角膜斑翳。角膜組織病理學檢查結(jié)果顯示C57BL/6小鼠的白念菌性角膜炎直至感染后的第14天仍有大量的炎性細胞浸潤，基質(zhì)層機化仍很明顯，而相應時間點Balb/c小鼠角膜內(nèi)炎性細胞浸潤量已明顯減少(P<0.05)，基質(zhì)層細胞數(shù)有所減少，角膜厚度趨于正常。真菌負荷檢測結(jié)果顯示兩種品系小鼠受染角膜真菌負荷數(shù)隨著天數(shù)的推移呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，至感染后第10天，真菌負荷數(shù)趨于0。但C57BL/6小鼠在相應各時間點角膜組織菌落計數(shù)都較Balb

5、/c小鼠多(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示感染早期兩種品系小鼠血漿及受染角膜組織中均有較高水平IL-17的表達，中后期IL-17的表達下降，IFN-γ的表達量則明顯升高。感染早期，C57BL/6小鼠血漿及受染角膜組織中IL-17的表達量均明顯高于Balb/c小鼠(P<0.05)；而在感染中后期C57小鼠血漿及受染角膜組織中IFN-γ的表達量明顯低于Balb/c小鼠(P<0.05)。免疫熒光技術(shù)檢測進一步驗證了ELISA的檢測結(jié)果，即

6、在白色念珠菌性角膜炎早期(24h)，受染角膜便可檢測到大量的IL-17，且C57BL/6小鼠角膜內(nèi)IL-17的表達明顯多于Balb/c小鼠。RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種品系小鼠受染角膜組織中大多數(shù)基因表達水平存在動態(tài)變化，MMP-8，MMP-9，TIMP-1于感染后的第3天迅速升高并達到高峰，這一現(xiàn)象在兩種品系小鼠的檢測結(jié)果中都可以觀察到，但在C57BL/6小鼠角膜內(nèi)這三個因子的表達量明顯高于Balb/c小鼠(P<0.05)；TIMP-

7、2、Co13a1及Co14a1的表達略有增高，其中Balb/c小鼠受染角膜內(nèi)Co13a1和Co14a1的表達量明顯高于C57BL/6小鼠(P<0.05)；Cak的中期，可見Co13a1和Co14a1的表達量繼續(xù)升高并達到高峰，且Balb/c小鼠依然明顯高于C57BL/6小鼠(P<0.05)，MMP-2、MMP-13和TIMP-2緩慢升高，而MMP-8，MMP-9及TIMP-1的表達量則明顯下降(P<0.05)；后期，除了MMP-2、MM