奶牛白色念珠菌性乳腺炎的快速診斷及中藥治療研究.pdf

1、為了尋找一種能夠快速診斷奶牛白色念珠菌性乳腺炎的方法和有效治療該病的中藥方劑，本研究進(jìn)行了共四個(gè)部分的試驗(yàn)，第一部分根據(jù)白色念珠菌ITS1-ITS2部分的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立了奶牛白色念珠菌性乳腺炎的PCR檢測(cè)方法；第二部分通過(guò)中藥藥敏試驗(yàn)，本著中醫(yī)辯證施治的原理，自擬了治療奶牛白色念珠菌性乳腺炎的純中藥方劑“乳炎消”；第三部分則對(duì)篩選出的中藥方劑的急性毒性和細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測(cè)；第四部分以奶山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物模型進(jìn)行了中藥治療

2、白色念珠菌性乳腺炎的研究，并進(jìn)行了“乳炎消”方劑的臨床治療試驗(yàn)。 第一部分用PCR方法診斷奶牛白色念珠菌性乳腺炎的研究查閱了GenBank已發(fā)表的ITS1-ITS2序列，根據(jù)白色念珠菌ITS1-ITS2部分的保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，對(duì)患牛乳樣中分離到的4珠白色念珠菌進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物均為500bp，檢測(cè)工作僅耗時(shí)2.5h；同時(shí)，對(duì)照試驗(yàn)表明，該對(duì)引物不能擴(kuò)增大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌等常見(jiàn)的乳房

3、炎致病細(xì)菌。敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的敏感性可達(dá)到1.25x103CFU/mL。對(duì)50份患牛乳樣進(jìn)行了細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)和生化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及PCR檢測(cè)，結(jié)果傳統(tǒng)方法檢測(cè)到白色念珠菌的陽(yáng)性率為16％，而PCR方法檢測(cè)到白色念珠菌的陽(yáng)性率為18％。傳統(tǒng)方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品，PCR檢測(cè)全部為陽(yáng)性。因此，用PCR方法檢測(cè)奶牛白色念珠菌性乳腺炎是一種快速、敏感和特異的方法，對(duì)獸醫(yī)臨床中白色念珠菌性乳腺炎的診斷具有一定的參考價(jià)值。 第二部分治療奶牛酵

4、母菌性乳腺炎中藥方劑的篩選本著中醫(yī)辨癥施治的原理，以調(diào)氣活血、消腫散淤、提高機(jī)體免疫力為原則，自擬了三組中藥方劑，進(jìn)行了單味中藥及三組自擬中藥方劑的體外平板抑菌試驗(yàn)，各單味中藥結(jié)果表明：黃連和黃芩對(duì)4種酵母菌的抑制作用均較強(qiáng)；而蒲公英、連翹、魚(yú)腥草對(duì)酵母菌沒(méi)有抑制作用；苦參、升麻、姜黃、仙鶴草對(duì)不同的酵母菌有一定的抑制作用。三組方劑結(jié)果表明：方劑1的抑菌效果明顯好于其它兩組方劑。在方劑1的基礎(chǔ)上調(diào)整篩選組方，最后篩選出一種純中藥方劑，定

5、名為“乳炎消”，并進(jìn)行了MIC(最低抑菌濃度)試驗(yàn)。結(jié)果表明，該方劑對(duì)白色念珠菌等奶牛酵母菌性乳腺炎的主要致病菌具有較好的抑菌效果，MIC值較低，平均為0.116g/mL。 第三部分中藥“乳炎消”方劑毒性檢測(cè)為了確保臨床用藥安全，通過(guò)不同的試驗(yàn)途徑和方法測(cè)定方劑“乳炎消”對(duì)小鼠的急性毒性和對(duì)L929(小鼠成纖維母細(xì)胞)細(xì)胞的毒性。體內(nèi)急性毒性試驗(yàn)進(jìn)行了半數(shù)致死量(LD50)和最大耐受量(MTD)為的檢測(cè)，用40g/kg體重劑量的

6、乳炎消方劑給小鼠灌胃，1周后小鼠未發(fā)生死亡，再在小鼠可接受的最大容積下，給小鼠灌服日累積劑量為120g/kg體重的乳炎消方劑進(jìn)行MTD試驗(yàn)，1周后處死觀察其病理變化。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用形態(tài)學(xué)觀察和MTT兩種方法，測(cè)試乳炎消方劑在L929體外培養(yǎng)中的最大無(wú)毒濃度(TC0)。結(jié)果表明；(1)乳炎消方劑毒性很低，其LD50超過(guò)40g/kg體重，MTD超過(guò)120g/kg體重。根據(jù)毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，可認(rèn)為中藥方劑在短期內(nèi)使用是安全的。(2)體外培養(yǎng)

7、結(jié)果顯示，乳炎消方劑對(duì)L929細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度達(dá)1.56g/L。 第四部分“乳炎消”方劑的治療效果研究本試驗(yàn)以30頭健康泌乳奶山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，將其分為三組：正常對(duì)照組、發(fā)病用藥組和發(fā)病末用藥組，每組10只。用白色念珠菌菌液1mL從乳頭管注入發(fā)病用藥組和發(fā)病末用藥組奶山羊的乳室，成功地誘發(fā)奶山羊急性乳炎腺的發(fā)生，48h后出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等炎癥反應(yīng)，并伴有精神萎靡，食欲下降等癥狀。并從患羊乳汁中分離到白色念珠菌。用乳炎消方劑給發(fā)

8、病用藥組灌服(2mL/kg體重)，每天一次，連用5天后發(fā)病用藥組羊只有8只康復(fù)，2只癥狀明顯減輕。而發(fā)病未用藥的羊只癥狀加重或無(wú)明顯改善，用藥前后分別采集三組奶山羊的血樣和乳樣進(jìn)行了血液流變學(xué)分析、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)和乳成份分析，血液流變學(xué)指標(biāo)的測(cè)定表明，治療前發(fā)病羊只的全血粘度、全血還原粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和剛性系數(shù)均顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，治療后發(fā)病用藥組上述指標(biāo)基本恢復(fù)正常，而發(fā)病末用藥組的各項(xiàng)指標(biāo)仍顯著高于正

9、常對(duì)照組(P＜0.05)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，治療前發(fā)病羊只的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著低于正常照組(P＜0.05)，治療后發(fā)病用藥組這一指標(biāo)基本恢復(fù)正常，而發(fā)病未用藥組仍顯著高于正常對(duì)照組。乳成分對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，治療前發(fā)病羊只的乳糖、乳脂肪顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，而乳蛋白、體細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.05)，治療后發(fā)病用藥組上述指標(biāo)基本恢復(fù)正常，而發(fā)病末用藥組無(wú)明顯變化。證明該中藥方劑能夠有效治療白色念珠菌性乳腺炎。 臨床治