Sul-F對心肌損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、芒柄花素(formononetin,7-羥基-4'-甲氧基異黃酮)為水溶性差、口服吸收差的異黃酮化合物,廣泛分布于甘草、葛根、紅車軸草等豆科植物中,具有解痙、降血脂、抗心律不齊、改善雌激素水平等作用;我們的體外研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的心肌保護作用;芒柄花素磺酸鈉(sodium formononetin-3'-sulfonate,Sul-F)是芒柄花素的磺化產(chǎn)物,在不影響藥理作用的前提下大幅度提高了水溶性,為了快速起效,制成了無菌注射液;我們

2、通過不同動物(大鼠、犬)、不同缺血模型(冠脈結(jié)扎致心肌缺血和缺血再灌注模型)、不同給藥方法(單次靜注、亞慢性連續(xù)靜注),考察了Sul-F的心肌保護作用,并通過體內(nèi)外心肌損傷模型,研究了Sul-F抗心肌缺血作用機制。
　　 第一部分,Sul-F對心肌缺血損傷的保護作用
　　 1.Sul-F對冠脈結(jié)扎致大鼠致急性心肌梗死的保護作用
　　 結(jié)扎大鼠左側(cè)冠脈制作急性心肌梗死模型,結(jié)扎5 min時尾靜脈注射給予2.5～16

3、0 mg/kg的Sul-F,觀察給藥后4 h之內(nèi)的心電圖變化,給藥6 h取心臟,TTC染色,比重法計算左心室心肌梗死百分比,ED50約為18.85 mg/kg。尾靜脈注射給予10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg的Sul-F,能降低冠脈結(jié)扎大鼠30～240min心電圖J點的抬高,抑制血清酶LDH、AST和CK活性的升高,縮小心肌梗死范圍。靜脈給予20mg/kg的Sul-F可顯著降低心肌梗死面積,而灌胃給予200和600mg

4、/kg劑量的Sul-F無效。
　　 2.Sul-F對冠脈結(jié)扎致大鼠心肌梗死的長期保護作用
　　 結(jié)扎大鼠左側(cè)冠脈制作急性心肌梗死模型,24 h后靜脈給予20 mg/kg的Sul-F,每天給藥1次,連續(xù)14天,Millar導管經(jīng)頸總動脈導入左心室測定血流動力學指標,取心臟計算心臟系數(shù)。結(jié)果顯示,Sul-F能顯著升高±dp/dtmax、SP、DP和AP,對LVSP、LVEDP和HR未見明顯影響。
　　 3.Sul-F

5、對冠脈結(jié)扎致犬急性心肌梗死的保護作用
　　 結(jié)扎Beagle犬冠狀動脈左前降支制作急性心肌梗死模型,結(jié)扎10 min時舌下靜脈注射給予3 mg/kg、6 mg/kg和12 mg/kg的Sul-F,觀察結(jié)扎4 h之內(nèi)的血流動力學指標和EECG變化,并在結(jié)扎前、結(jié)扎2 h和結(jié)扎4 h分別取動脈血測定血氧,血流動力學測定完畢采血測定血清LDH、AST、CK活性,同時測定心肌梗死百分比。結(jié)果顯示:6～12 mg/kg的Sul-F可抑制冠

6、脈結(jié)扎犬的Σ-ST和N-ST升高、降低心肌梗死范圍,抑制血清LDH、CK和AST活性升高。6～12 mg/kg的Sul-F在冠脈結(jié)扎后不同時間點抑制CO、SV、SW、CI和SI的降低,抑制SP、DP、AP、LVSP、±dp/dt max的降低;6～12 mg/kg的Sul-F在冠脈結(jié)扎不同時間點抑制CBF、MBF和MOCI的降低,抑制MOUR的升高;12mg/kg的Sul-F抑制TPVR的升高。3～12 mg/kg的Sul-F對冠狀動脈

7、結(jié)扎犬LVEDP、HR、MVO2無明顯影響。
　　 第二部分,Sul-F對心肌缺血再灌注損傷的保護作用
　　 1.Sul-F對缺血再灌注致大鼠急性心肌梗死的保護作用;
　　 制作大鼠心肌缺血再灌注心肌梗死模型,再灌5 min時尾靜脈注射給予10mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg的Sul-F,觀察3 h之內(nèi)的心電圖變化,給藥3 h后測定血流動力學,采血測定血清酶活,取心臟計算左心室心肌梗死百分比。結(jié)果顯

8、示,20～40 mg/kg的Sul-F能夠降低缺血再灌注大鼠心電圖J點的抬高和心肌梗死范圍,升高+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVSP、DP和AP,顯著降低大鼠血清CK、LDH和AST活性。
　　 2.Sul-F對缺血再灌注致大鼠心肌梗死的長期保護作用
　　 制作大鼠心肌缺血再灌注心肌梗死模型,24 h后靜注20 mg/kg的Sul-F,每天給藥1次,連續(xù)14天,Millar導管測定血液動力學指標,取心臟,計算

9、臟器系數(shù),常規(guī)病理切片,行HE染色和Masson染色,觀察病理組織學變化,計算心肌膠原容積分數(shù)(CVF)。結(jié)果顯示,亞慢性給予Sul-F能抑制+dp/dtmax和-dp/dtmax的降低,可減輕缺血再灌注損傷引起的心肌纖維斷裂缺損、心肌細胞壞死伴纖維化和炎性細胞浸潤,降低CVF百分率。
　　 第三部分,Sul-F抗心肌缺血和缺血再灌注損傷的作用機制研究
　　 1.Sul-F對H9c2細胞氧化損傷的保護作用及機制研究

10、>　　 H9c2細胞貼壁24 h,加入含不同濃度的Sul-F培養(yǎng)24 h,加入100μM的H2O2,孵育1 h。采用細胞流式細胞儀,Annexin-V和PI雙染心肌檢測凋亡率,R123染色法檢測細胞膜電位,Fluo-3染色法檢測細胞內(nèi)鈣;ELISA法檢測上清液Bcl-2和Bax表達。結(jié)果顯示,31.2～62.5 nM的Sul-F可降低H2O2誘導的心肌細胞損傷;25～156 nM的Sul-F均能降低H2O2引起的細胞凋亡發(fā)生率,抑制H

11、2O2誘導的細胞膜電位降低;62.5 nM Sul-F能抑制缺氧心肌細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高;62.5～156nM的Sul-F可導致Bcl-2表達量和Bcl-2/Bax比值顯著升高。
　　 2.Sul-F對缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響
　　 制作大鼠心肌缺血再灌注心肌梗死模型,灌注5 min時尾靜脈注射給予20mg/kg的Sul-F,再灌注185min取心臟,常規(guī)病理切片,行TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡,免疫組化染

12、色檢測Bcl-2、Bax和p-Akt蛋白表達。結(jié)果顯示:20 mg/kg的Sul-F能夠抑制缺血再灌大鼠心肌細胞的凋亡,提高Bcl-2蛋白的表達和Bcl-2/Bax比值,增加p-Akt蛋白表達。
　　 綜上所述,Sul-F急性給藥和亞慢性給藥均可縮小心肌缺血或缺血再灌注損傷的心肌梗死面積,降低血清酶活性,改善血液動力學,增強心臟功能,減輕心肌病理改變;降低氧化損傷引起的細胞鈣超載、抑制線粒體膜電位改變。其作用機制可能與激活PI3