蕨麻醇提取物對(duì)缺氧性心肌損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究蕨麻乙醇提取物對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，對(duì)慢性缺氧小鼠心肌損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。 方法：細(xì)胞培養(yǎng)研究：(1)取新生1-3d的SD大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)，采用MTT法檢測(cè)不同缺氧時(shí)間細(xì)胞的存活率，以確定心肌細(xì)胞的最佳缺氧時(shí)間，建立心肌細(xì)胞缺氧損傷模型。(2)將搏動(dòng)狀態(tài)良好，生長(zhǎng)密度無(wú)明顯差異的心肌細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組、缺氧損傷模型組、蕨麻醇提物0.024g/ml、0.012g/ml、0.006g/ml干

2、預(yù)組(缺氧同時(shí)加入蕨麻乙醇提取物)。缺氧6h后，采用生化手段檢測(cè)培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)活性，研究蕨麻對(duì)缺氧致心肌細(xì)胞膜損傷的保護(hù)作用；檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性及脂質(zhì)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，研究蕨麻對(duì)缺氧致心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的保護(hù)作用；采用H.E染色、透射電鏡技術(shù)研究蕨麻對(duì)缺氧損傷心肌細(xì)胞組織形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)的影響；采用Hochest-PI染色及流式細(xì)胞術(shù)，研究蕨麻對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響；

3、采用細(xì)胞免疫染色方法探討蕨麻影響缺氧損傷心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究：健康成熟雌性小鼠(25-30g)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、慢性缺氧模型組、蕨麻醇提物5g/kg、2.5g/kg干預(yù)組(每日缺氧前1小時(shí)給予蕨麻乙醇提取物)。模型組與蕨麻干預(yù)組小鼠置于自制缺氧罐內(nèi)，通入含(10±0.5)％02的氮氧混合氣體，8h/d，連續(xù)14d，建立慢性缺氧小鼠損傷模型。對(duì)照組于外界正常環(huán)境下飼養(yǎng)。末次缺氧結(jié)束后立即處死各組小鼠，取血清檢測(cè)L

4、DH、CK、SOD活性及MDA含量；取心肌組織做石蠟切片，進(jìn)行Nagar-Olsen特殊染色，觀察各組心肌缺氧損傷程度，進(jìn)行bcl-2、p53免疫組織化學(xué)染色，計(jì)數(shù)各組心肌bcl-2、p53陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，圖像分析處理系統(tǒng)下測(cè)定各組bcl-2、p53陽(yáng)性細(xì)胞面積。 結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)研究：(1)心肌細(xì)胞缺氧損傷0-6h，細(xì)胞活性變化幅度最大，單位時(shí)間內(nèi)細(xì)胞缺氧損傷程度最大，確定6h為最佳缺氧時(shí)間點(diǎn)(2)蕨麻乙醇提取物各劑量組可顯著降低缺

5、氧損傷心肌細(xì)胞LDH、CK的外漏量(P＜0.01)；可顯著提高缺氧損傷細(xì)胞內(nèi)SOD活性(P＜0.01)，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生(P＜0.05)。(3)蕨麻乙醇提取物(0.024g/ml)可有效減輕缺氧損傷心肌細(xì)胞：腫脹變形、胞膜破裂、胞漿空泡化及DNA凝集等損傷變化。(4)蕨麻乙醇提取物(0.024g/ml)可明顯降低缺氧損傷細(xì)胞凋亡的百分率(P＜0.05)。(5)蕨麻乙醇提取物可顯著上凋缺氧損傷心肌細(xì)胞內(nèi)bcl-2蛋白的表達(dá)(P＜0.01)

6、，降低p53蛋白的表達(dá)(P＜0.01)。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究：(1)給予蕨麻乙醇提取物5g/kg，可顯著降低慢性缺氧損傷小鼠血清中LDH活性(P＜0.01)、CK活性(P＜0.05)，提高SOD活力(P＜0.05)，減少M(fèi)DA的產(chǎn)生(P＜0.01)；而給予蕨麻乙醇提取物2.5g/kg，小鼠血清中心肌酶活性、SOD活力及MDA含量，與慢性缺氧模型組比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。(2)給予蕨麻乙醇提取物5g/kg，可有效減輕心肌組織

7、缺氧損傷程度，而給予蕨麻乙醇提取物2.5g/kg無(wú)明顯作用。(3)5g/kg蕨麻乙醇提取物可顯著上調(diào)慢性缺氧損傷小鼠心肌bcl-2蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，降低p53蛋白的表達(dá)(P＜0.05)；而2.5g/kg組與慢性缺氧模型組比較，差別均無(wú)顯著性(P＞0.05)。 結(jié)論：蕨麻乙醇提取物能夠顯著減輕缺氧對(duì)體外培養(yǎng)大鼠乳鼠心肌細(xì)胞的損傷，減輕慢性缺氧對(duì)小鼠心肌的損傷，使細(xì)胞、心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能基本恢復(fù)正常。這種保護(hù)作用的機(jī)制可