耳聾相關(guān)的線粒體tRNAIIeA4317G突變對細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　1、在浙江省各地區(qū)特殊教育學(xué)校、殘聯(lián)、語言康復(fù)中心、各合作醫(yī)療單位和社會單位收集非綜合征型耳聾(nonsyndromic sensorineural hearing loss，NSHL)病例臨床資料并采集患者外周血。
　　2、在線粒體A1555G突變?nèi)巳褐泻Y查線粒體tRNAThr和tRNAIle基因，分析篩查結(jié)果，完善浙江省藥物性非綜合征型耳聾資源庫。
　　3、分析一個同時攜帶有線粒體12S rRNA A1

2、555G突變和線粒體tRNAThrC15910T突變家系的臨床資料和分子遺傳學(xué)特征。
　　4、構(gòu)建含有mt tRNATle A4317G突變和mt12S rRNA A1555G突變的永生化淋巴母細(xì)胞系(lymphoblastoid cell lines，LCLs)，保存耳聾資源，同時為后續(xù)研究A4317G在耳聾中的致病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　5、對LCLs進(jìn)行線粒體功能實(shí)驗(yàn)，初步探討線粒體tRNAIle A4317G突變對耳

3、聾表型的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1、收集浙江省內(nèi)NSHL患者以及聽力正常的體格健康人群的臨床資料和血液樣本。對收集的臨床資料進(jìn)行整理分析。收集耳聾患者外周血液樣本，提取全基因組DNA，建立浙江省耳聾人群臨床和分子流行病學(xué)調(diào)查資料數(shù)據(jù)庫。
　　2、通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerise chain reaction，PCR）技術(shù)擴(kuò)增線粒體12SrRNA基因，對攜帶線粒體A1555G突變患者進(jìn)一步篩查線粒體tRNAI

4、le和tRNAThr基因，對可疑位點(diǎn)的保守性、基因多態(tài)性以及可能造成的功能改變進(jìn)行分析。
　　3、調(diào)查同時攜帶有線粒體12Sr RNA A1555G突變和線粒體tRNAThr C15910T突變家系(FE141)的臨床資料和遺傳學(xué)特征。
　　4、在以往工作基礎(chǔ)上，完善同時攜帶A1555G和A4317G突變的中國漢族耳聾家系(FE163)的臨床資料，分析該家系母系成員線粒體單體型、評估tRNAIle4317位點(diǎn)保守性以及軟件預(yù)

5、測A4317G突變對線粒體tRNAIle二級結(jié)構(gòu)的作用，總體評估m(xù)t tRNAIle A4317G突變潛在的致聾基礎(chǔ)。
　　5、 EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）轉(zhuǎn)染人外周血中的B淋巴細(xì)胞(Blymphocyte cell，BLC)，構(gòu)建三組LCLs:同時攜帶mt12S rRNA基因A1555G突變和mt tRNAIle基因A4317G突變的東亞單體型B的NSHL耳聾患者;僅含有mt12S rRNA A15

6、55G突變且單體型為東亞單體型B的NSHL耳聾患者;無致病性mtDNA突變的東亞單體型B人群。
　　6、對構(gòu)建的LCLs細(xì)胞的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平、線粒體膜電位(mitochondridal membrane potential，MMP)以及細(xì)胞倍增時間(doublingtime，DT)進(jìn)行測定，初步分析構(gòu)建的LCLs的功能改變。
　　7、統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0分析LCLs

7、功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測數(shù)據(jù)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、所有A1555G突變樣本和正常對照樣本mt tRNAIle基因篩查僅發(fā)現(xiàn)A4317G突變。4317位點(diǎn)位于tRNAIle高度保守的T臂區(qū)，位點(diǎn)保守性指數(shù)(ConservativeIndex，CI)為87.5％。當(dāng)A4317突變?yōu)镚4317后，形成了新的C-G配對，改變了tRNAIleT臂的結(jié)構(gòu)。
　　2、tRNAThr基因篩查發(fā)現(xiàn)T15889C、C15910

8、T、A15924G、G15927A和T15943C5個位點(diǎn)，其中T15943C未有文獻(xiàn)報道。通過分析發(fā)現(xiàn)tRNAThrC15910T和T15943C僅在NSHI患者中存在。兩個位點(diǎn)的保守性都極高(CI均為93.3％)，很可能是與耳聾相關(guān)的繼發(fā)性突變位點(diǎn)。
　　3、線粒體12S rRNAA1555G、tRNAIleA4317G和tRNAThrC15910T突變只存在于母系成員中，父系成員及其配偶均未檢測到。
　　4、FE141

9、家系母系成員mtDNA全序列分析共發(fā)現(xiàn)36個位點(diǎn)堿基改變，tRNA基因上僅發(fā)現(xiàn)tRNAThrC15910T突變。FE141家系母系成員線粒體全序分析發(fā)現(xiàn)線粒體DNA單體型屬于東亞單體型F3b。FE163家系除A1555G突變和A4317G突變外還有36個位點(diǎn)堿基改變。線粒體DNA全序列分析發(fā)現(xiàn)該家系母系成員mtDNA單體型為東亞單體型B4c。
　　5、FE163家系LCLs細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與僅攜帶A1555G突變或者無突變的LC

10、Ls細(xì)胞組相比，該耳聾家系LCLs細(xì)胞ROS水平分別增加41.86％和79.07％，MMP水平分別降低36.82％和63.7％，細(xì)胞倍增時間在葡萄糖培養(yǎng)基中分別延長1.6％和71.1％，在乳糖培養(yǎng)基中分別延長0.3％和32.2％。
　　結(jié)論：
　　1、攜帶A1555G突變的耳聾人群mt tRNAIle和tRNAThr基因突變篩查發(fā)現(xiàn)，其中3個突變不存在于正常人群中，推測mt tRNAIle和tRNAThr基因很可能與線粒體D

11、NA基因突變導(dǎo)致的NSHL有關(guān)。
　　2、線粒體tRNAIle基因A4317G(A59G)突變形成了新的G-C配對，改變了tRNAIle T臂的結(jié)構(gòu)，可能阻止mt tRNAIle CCA-加尾，影響了其氨基酰化水平，導(dǎo)致tRNAIle結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，最終可能影響蛋白的合成。線粒體tRNAThr基因15910位點(diǎn)在tRNAThr的D莖上，保守性指數(shù)達(dá)93.3％，在3216例對照中未發(fā)現(xiàn)該突變，是一個高度保守的位點(diǎn)。當(dāng)15910位點(diǎn)的C突變

12、為T時，高度保守的C-G配對破壞，該位點(diǎn)的改變類似于T15908C，可能協(xié)同A1555G突變影響耳聾的表型表達(dá)。
　　3、線粒體A1555G突變家系母系成員耳聾臨床表型相差很多:聽力下降水平、聽力開始下降的時間以及耳聾家系發(fā)病率等方面存在明顯差異，這提示核基因及其環(huán)境因素也可能參與了耳聾的發(fā)展。
　　4、初步的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了mt tRNAIle基因A4317G突變可能加強(qiáng)A1555G突變對耳聾表型的影響。但并不能完全