母系遺傳2型糖尿病相關的線粒體tRNA突變及其功能研究.pdf

1、2型糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，常伴有碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂。長期存在的高血糖會導致眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)等組織和器官的慢性損害以及功能障礙。糖尿病是由遺傳和環(huán)境等因素共同作用引起的，研究發(fā)現(xiàn)，部分糖尿病具有母系遺傳特征，提示線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)突變可能是糖尿病病的遺傳基礎之一。本研究對2型糖尿病人群進行遺傳篩查，發(fā)現(xiàn)了兩個具有母系遺傳特性的漢族糖尿病家系。對兩個家系的母系

2、成員線粒體基因組進行測序發(fā)現(xiàn)，其中一個家系母系成員存在共同的甘氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸(glycine transfer RNA，tRNAGly) T10003C突變，屬于M11b單倍體型;另外一個家系的母系成員存在共同的谷氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸(glutamic acidtransfer RNA，tRNAGlu) A14692G突變，屬于B5單體型。
　　原核生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移核糖核酸（transfer RNA，tRNA），以及絕大部分真核生物細

3、胞質(zhì)中的tRNA都具有經(jīng)典的二級結(jié)構(gòu)，即三葉草結(jié)構(gòu)。此外，tRNA分子還可以通過莖環(huán)之間的扭轉(zhuǎn)使不同結(jié)構(gòu)域的堿基之間形成氫鍵，進而維持tRNA分子穩(wěn)定的倒L形三級結(jié)構(gòu)。與上述兩種tRNA不同，人線粒體tRNA二級結(jié)構(gòu)中的A∶U配對和非Watson-Crick配對的數(shù)目偏多，同時具有縮短甚至缺失的莖環(huán)部分，這也導致了線粒體tRNA的低穩(wěn)定性。此外，線粒體內(nèi)的高氧化環(huán)境，使得線粒體tRNA的堿基非常容易受到突變的影響。
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4、位于tRNAGly D臂保守的13位，U到C的轉(zhuǎn)換與22位的G形成了13C-22G的新堿基配對。Northern Blot實驗發(fā)現(xiàn)攜帶該突變的母系成員線粒體tRNAGly水平相較于對照細胞平均下降了約70％。tRNAGly穩(wěn)態(tài)水平的降低導致患者細胞線粒體蛋白質(zhì)合成水平較對照細胞下降了32.5％。線粒體蛋白質(zhì)合成障礙進一步導致了線粒體氧化呼吸鏈復合體損傷，并影響細胞呼吸效率。經(jīng)測定，患者細胞的線粒體基礎氧氣消耗速率(Oxygen cons

5、umption rate，OCR)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)偶聯(lián)OCR、質(zhì)子漏OCR、最大OCR、緩沖OCR和非線粒體OCR分別是對照細胞的53％、45％、84％、40％、39％和32％。線粒體呼吸異常會導致活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平增加及氧化磷酸化和ATP合成的解偶聯(lián)，減少ATP的合成，導致細胞能量代謝失衡，從而影響糖尿病的發(fā)生發(fā)展。
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6、92位于tRNAGlu TΨC環(huán)的55位(U55)，體內(nèi)該位點被修飾成假尿嘧啶（Ψ55），與18位的A形成18A-55Ψ配對，與U19-G56一起維持tRNAGlu高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而A14692G突變則在55位引入了胞嘧啶(C)，破壞了原有的修飾與氫鍵配對。因此，該突變導致tRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，D環(huán)和T環(huán)之間的相互作用被打斷，因此將D環(huán)和T環(huán)暴露出來，更容易被血管生成素識別并切割。在非變性電泳中，突變體的遷移率小于野生型;同時熱變

7、性實驗結(jié)果表明，tRNAGlu A14692G突變體的Tm值(46℃)低于野生型tRNA(50℃)，這些數(shù)據(jù)均表明突變體tRNA具有更加疏松的構(gòu)象和較低的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。此外，攜帶該突變的細胞的tRNAGlu穩(wěn)態(tài)水平較對照細胞下降了64.5％。線粒體DNA編碼的多肽合成在攜帶突變的細胞中有不同程度的下降，從20％到66％不等，平均下降了29％。突變細胞的基礎OCR、ATP偶聯(lián)OCR、質(zhì)子漏OCR、最大OCR、緩沖OCR和非線粒體OCR分別是

8、對照細胞的59.5％、61％、56％、64％、67％和71.5.％。同時線粒體復合物活力檢測也表明，復合物Ⅰ和復合物Ⅳ受到不同程度的影響，與對照細胞株相比，突變細胞復合物Ⅰ的活力只有野生型的52％，復合物Ⅳ為75％。突變體細胞中線粒體產(chǎn)生的ATP降低了39％。同時，線粒體膜電位下降了35％，ROS產(chǎn)生增加了33％。由tRNAGluA14692G突變引起的tRNAGlu結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定及代謝紊亂，進而影響了線粒體的各項功能，最終導致細胞功能障礙