2型糖尿病家系線粒體DNA異質(zhì)性突變位點(diǎn)檢測方法的建立及相關(guān)細(xì)胞功能的研究.pdf

1、目的：
　　1.收集母系遺傳2型糖尿病家系，通過高通量捕獲測序技術(shù)對其線粒體全基因組DNA進(jìn)行捕獲測序，并定性和定量分析其2型糖尿病相關(guān)異質(zhì)性突變位點(diǎn);
　　2.EB病毒轉(zhuǎn)化先證者外周血B淋巴細(xì)胞，建立A3243G突變永生細(xì)胞株后通過單細(xì)胞篩選，建立相同核背景下不同異質(zhì)水平的A3243G突變永生細(xì)胞株，并研究mtDNA A3243G異質(zhì)性突變與線粒體功能的關(guān)系。
　　3.為檢測永生細(xì)胞株線粒體DNA A3243G突變異

2、質(zhì)水平建立一種簡便但相對準(zhǔn)確敏感的定量檢測方法。
　　對象與方法：
　　1.標(biāo)本采集:病例收集依托溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科室。收集1個(gè)母系遺傳2型糖尿病家系（共12人），同時(shí)采集12人外周血進(jìn)行常規(guī)生化指標(biāo)檢測并詢問記錄基本臨床資料。
　　2.提取母系家庭成員（n=12人）外周血總DNA，調(diào)整其純度和濃度后送往北京邁基諾測序公司進(jìn)行線粒體全基因組高通量捕獲測序，并對所有測序結(jié)果進(jìn)行整理，分析2型糖尿病相關(guān)線粒體

3、DNA異質(zhì)性突變位點(diǎn)及其母系遺傳特點(diǎn)。
　　3.采集母系遺傳2型糖尿病家系先證者外周血和1例相同單體型健康人的外周血，通過EB病毒轉(zhuǎn)化，建立永生細(xì)胞系。并根據(jù)有限稀釋法，制備不同異質(zhì)水平的mtDNA A3243G突變永生細(xì)胞株。
　　4.為了隨時(shí)方便檢測永生細(xì)胞株mtDNA A3243G異質(zhì)性突變水平，建立并完善實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合阻滯形成系統(tǒng)技術(shù)（RT-ARMs-qPCR）。
　　5.利用流式細(xì)胞技術(shù)、激光共聚焦技

4、術(shù)、高效液相色譜技術(shù)和透射電鏡技術(shù)對不同異質(zhì)水平永生細(xì)胞株和對照永生細(xì)胞株分別進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活性氧水平(ROS)、線粒體數(shù)量、線粒體膜電位、細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷水平(ATP)、線粒體形態(tài)檢測，并統(tǒng)計(jì)分析其差異。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過線粒體全基因組高通量捕獲測序技術(shù)共檢測到41個(gè)同質(zhì)性突變位點(diǎn)，經(jīng)過氨基酸比對和不同物種間的保守性分析后，可以排除這41個(gè)同質(zhì)性突變位點(diǎn)的糖尿病致病作用;同時(shí)檢測出5個(gè)高異質(zhì)水平突變位點(diǎn)(＞

5、10％)，包括致病性突變位點(diǎn)A3243G和非致病性突變位點(diǎn)C150T、T152C、T4823C、G7600A。
　　2.本家系母系成員線粒體DNA A3243G異質(zhì)水平為11％-73％，而不同年齡段所攜帶不同水平突變，40歲以上為15％左右，而20歲-30歲異質(zhì)水平介于11％-73％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析y=-0.01x+0.67。
　　3.建立和完善mtDNA A3243G突變異質(zhì)水平的檢測方法，在做相關(guān)性分析后，得出相關(guān)系

6、數(shù)R2=0.998，同時(shí)檢測本家系A(chǔ)3243G突變攜帶者外周血mtDNA突變異質(zhì)性，其檢測結(jié)果與高通量測序結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.通過EB病毒轉(zhuǎn)化，成功建立A3243G突變永生細(xì)胞株和正常對照永生細(xì)胞株。
　　4.根據(jù)有限稀釋法，得到兩種不同異質(zhì)的永生細(xì)胞株（80％和95％）;通過線粒體功能檢測發(fā)現(xiàn)，永生細(xì)胞株內(nèi)A3243G突變異質(zhì)水平在80％時(shí)，除細(xì)胞內(nèi)ATP水平以外的其他檢測，如ROS、膜電位、凋亡率與正常對照永

7、生細(xì)胞株差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而95％異質(zhì)水平的永生細(xì)胞株其線粒體功能包括細(xì)胞內(nèi)ATP水平的其他檢測與正常對照永生細(xì)胞株的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.透射電鏡結(jié)果顯示，A3243G突變永生細(xì)胞株與正常對照永生細(xì)胞株的線粒體相比，出現(xiàn)融合和分裂異常。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建線粒體全基因組高通量測序技術(shù)平臺(tái)，通過對母系遺傳2型糖尿病家系的線粒體全基因組DNA檢測發(fā)現(xiàn)除A3243G異質(zhì)性突變以外沒有其它病理性突變位點(diǎn)。

8、
　　2.mtDNAA3243G突變異質(zhì)水平低于15％的情況下，可以突破生殖細(xì)胞的遺傳瓶頸傳遞給后代;同時(shí)，mtDNA A3243G突變異質(zhì)水平與年齡成負(fù)相關(guān)。
　　3.RT-ARMs-qPCR技術(shù)檢測mtDNAA3243G突變異質(zhì)水平是可靠的，可以用于永生細(xì)胞株mtDNA A3243G突變異質(zhì)水平的檢測。
　　4.mtDNAA3243G突變永生細(xì)胞株異質(zhì)水平在80％時(shí)，其線粒體氧化磷酸化功能未受損，其原因可能是由于線