延邊地區(qū)牛氣腫疽流行病學(xué)調(diào)查及CctA基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、氣腫疽(Clostridium chauvoei infection)，病原為氣腫疽梭菌，是一種急性、熱性、敗血性傳染病。常見的典型癥狀為肌肉豐滿部位發(fā)生炎性、氣性腫脹，觸壓有捻發(fā)音，有一定的地區(qū)流行性、季節(jié)性，多發(fā)生在潮濕的山谷牧場(chǎng)、天氣炎熱的多雨季節(jié)。近幾年吉林省延邊州相繼爆發(fā)牛氣腫疽，給畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展帶來了巨大的沖擊和經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也逐漸地威脅到人類的安全和生產(chǎn)。
　　本研究根據(jù)NCBI上氣腫疽梭菌細(xì)胞毒素A（CctA

2、）基因序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物。一方面，將采集延邊地區(qū)165頭份的牛血液樣本，分別進(jìn)行血涂片鏡檢和PCR檢測(cè)，再應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)各組數(shù)據(jù)分析。另一方面，采用疑似感染氣腫疽梭菌的牛肝臟、脾臟、心臟及肌肉等組織進(jìn)行分離，應(yīng)用病原學(xué)檢查、生化鑒定、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。將PCR擴(kuò)增的CctA基因克隆至pMD19-T simple載體，對(duì)測(cè)序正確的CctA基因序列分析，然后亞克隆至pVAX-1真核表達(dá)載體，將構(gòu)建的pVAX1-CctA真

3、核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞中，通過間接免疫熒光(IFAT)和免疫印跡（Western blotting）檢測(cè)CctA基因的表達(dá)產(chǎn)物。
　　結(jié)果顯示，PCR方法檢測(cè)牛氣腫疽的平均陽性率為15.2％，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，牛氣腫疽感染率在不同縣市、不同品種之間差異性不顯著（P＞0.05）；而不同年齡、不同地理?xiàng)l件氣腫疽感染率差異性顯著（P＜0.05）；在個(gè)體農(nóng)戶的飼養(yǎng)方式中陽性率顯著高于規(guī)?；酿B(yǎng)殖方式（P＜0.01）；說明牛感染氣腫疽

4、梭菌主要受年齡段、地理?xiàng)l件、飼養(yǎng)方式等因素的影響較大。氣腫疽梭菌擴(kuò)增的CctA基因大小為501bp，測(cè)序得到的CctA基因核苷酸與氨基酸序列與氣腫疽梭菌ATCC10092菌株進(jìn)行同源性比對(duì)分析，有3處點(diǎn)核苷酸突變，核苷酸序列同源性為99.4%；存在著2個(gè)位點(diǎn)的氨基酸特異性改變，氨基酸序列同源性為98.8%。轉(zhuǎn)染的pVAX1-CctA組的細(xì)胞有綠色熒光，且pVAX1-CctA重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物大小約為19kDa，表明pVAX1-CctA質(zhì)粒