BMP2在雌激素變化參與的皮膚衰老過(guò)程中的作用機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)BMP2在雌激素變化參與的皮膚衰老過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：BMP-2在雌激素抗去勢(shì)大鼠皮膚衰老中的作用研究。
　　 目的：探討雌激素水平對(duì)皮膚組織的影響，為臨床上絕經(jīng)后婦女皮膚衰老的發(fā)病機(jī)制及皮膚組織病理學(xué)變化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：30只雌性成年Wistar大鼠，隨機(jī)分為去勢(shì)組(ovariectomized group，Mod，n=10)、假手術(shù)組(sham-

2、operated group，Sham，n=10)、去勢(shì)+雌激素組（ovariectomized and estrogen injection group，OEI，n=10）;去勢(shì)組切除雙側(cè)卵巢，大鼠術(shù)前禁水，取6％水合氯醛(0.5mL/100mg)腹腔注射，麻醉后固定四肢，在脊柱兩側(cè)第12肋尾側(cè)剪毛，用2％碘酊皮膚消毒，75％酒精脫碘。沿脊柱后正中線外側(cè)1～1.5cm處，以縱形切口依次切開皮膚、分離肌肉、打開壁層腹膜，進(jìn)入腹膜腔，找到

3、卵巢并切除。假手術(shù)組步驟同去勢(shì)組，但不切除卵巢，只切除卵巢周圍小部分脂肪組織。去勢(shì)+雌激素組:切除大鼠雙側(cè)卵巢后，于術(shù)后第2天開始皮下注射雌二醇0.05mg/d，持續(xù)6天。大鼠飼養(yǎng)6周后腹腔注射水合氯醛后背部?jī)裘?，在背部脊柱兩?cè)分別取全層皮膚，主要為真皮成分，共切割2個(gè)圓形創(chuàng)面，直徑1.8 cm，深至皮下，內(nèi)、外兩側(cè)分別做HE染色標(biāo)本和免疫組化標(biāo)本。采用放射免疫方法檢測(cè)了血清雌二醇水平，免疫組化方法檢測(cè)了皮膚組織BMP-2蛋白的表達(dá);應(yīng)

4、用光學(xué)顯微鏡對(duì)皮膚組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，苦味酸-天狼猩紅染色偏振光分析皮膚膠原沉積，分析大鼠皮膚中Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例，所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 結(jié)果：⑴去勢(shì)組術(shù)后6周后血清雌二醇的濃度顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，去勢(shì)+雌激素組6周后血清雌二醇的濃度顯著高于去勢(shì)組(P＜0.05)。⑵去勢(shì)組大鼠喂養(yǎng)6周后皮膚組織各層的細(xì)胞萎縮，導(dǎo)管周圍的結(jié)締組織纖維增加并出現(xiàn)纖維化，

5、部分腺泡失去正常結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核沒(méi)有明顯變化，細(xì)胞質(zhì)明顯減少，細(xì)胞核密集在一起，腺泡呈現(xiàn)出萎縮的狀態(tài);⑶苦味酸-天狼猩紅法發(fā)現(xiàn)去勢(shì)組術(shù)后6周皮膚中Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例顯著低于假手術(shù)組(P＜0.05)，去勢(shì)+雌激素組6周皮膚中Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例顯著高于去勢(shì)組(P＜0.05)，而假手術(shù)組與去勢(shì)+雌激素組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。⑷免疫組化法發(fā)現(xiàn)去勢(shì)組6周皮膚組織

6、BMP-2蛋白表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)，去勢(shì)+雌激素組皮膚組織中BMP-2蛋白水平明顯低于去勢(shì)組(P＜0.05)。⑸去勢(shì)組血清雌二醇水平與BMP-2蛋白表達(dá)有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.9600, P=0.0400)。
　　 結(jié)論：去勢(shì)組大鼠6周后皮膚上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，呈萎縮狀態(tài)，功能減退，Ⅰ和Ⅲ膠原的含量以及Ⅰ/Ⅲ膠原的比例明顯降低，BMP-2表達(dá)上調(diào)，增加雌激素對(duì)膠原的降解，降低真皮的厚度及彈性，這可能是雌激素水平

7、降低導(dǎo)致皮膚衰老的發(fā)病機(jī)制。
　　 第二部分：雌激素對(duì)體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞BMP-2表達(dá)的影響。
　　 目的：通過(guò)研究雌激素對(duì)體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞BMP-2蛋白的影響，探討雌激素減緩皮膚老化的機(jī)制。
　　 方法：將皮膚標(biāo)本，用含有抗生素的PBS液清洗皮膚組織的血液和污漬，剪去皮膚組織后，用0.25％胰蛋白酶消化清潔皮膚標(biāo)本，4℃條件下作用14h，分離表皮和真皮組織，棄去表皮組織后，把其余的真皮組織用含1％

8、膠原酶的37℃的MEM液，在5％二氧化碳培養(yǎng)箱中作用4h，以分離成纖維細(xì)胞，收集和洗滌所得的細(xì)胞，新分離出的成纖維細(xì)胞密度約4×104/mL，加入到含10％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)成密集單層后，細(xì)胞密度約16×104/mL，以1∶3的比例進(jìn)行傳代，在孵化箱中培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞密度約達(dá)12×104/mL時(shí)，供后續(xù)的實(shí)驗(yàn)使用。所有細(xì)胞都在無(wú)血清MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后將將細(xì)胞分為4組:第1組為雌

9、激素刺激組:分別向3個(gè)培養(yǎng)瓶中加入不同濃度的雌激素(1×10-1mol/L，1×10-2mol/L，1×10-3mol/L);第2組為Noggin拮抗組:分別向3個(gè)培養(yǎng)瓶中加入含不同濃度BMP2拮抗劑noggin(Noggin終濃度10，20，30μg/ml);第3組為雌激素刺激+noggin拮抗組:分別向3個(gè)培養(yǎng)瓶中加入含不同濃度的雌激素（雌激素終濃度分別為:1×10-1 mol/L，1×10-2mol/L，1×10-3mol/L）+

10、含不同濃度Noggin(Noggin終濃度10，20，30μg/mL)第4組為正常對(duì)照組:不做任何干預(yù)的體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞。取每組體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞中，采用Westernblot檢測(cè)大鼠成纖維細(xì)胞中BMP2蛋白，以及免疫組化法觀察大鼠成纖維細(xì)胞中BMP2顆粒的多少，從而判斷BMP-2蛋白的表達(dá)水平。透射電鏡觀察不同雌激素濃度處理組對(duì)于成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　 結(jié)果：體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞，增殖活躍，形態(tài)表現(xiàn)良好，

11、出現(xiàn)典型的梭形和柳葉形，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法描繪細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示:潛伏期為0至2天，指數(shù)生長(zhǎng)期為2～5天，然后進(jìn)入平臺(tái)期。對(duì)成纖維細(xì)胞用雌二醇干預(yù)，免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果顯示低劑量組與對(duì)照組作比較，兩組的BMP-2蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，高劑量組的雌激素與對(duì)照組相比，高劑量組的雌激素組的BMP-2表達(dá)蛋白水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。透射電鏡下觀察到成纖維細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮，出現(xiàn)