睪丸引帶發(fā)育過(guò)程中雌激素受體的表達(dá).pdf

1、背景與目的：雌激素與男性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系密切。近年來(lái)研究表明，雌激素異常，包括外源性雌激素（EEs）的影響與日益增加的男性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育異常/畸形密切相關(guān)。究其機(jī)理，除了經(jīng)典的雌激素核受體ERα、ERβ外，新近發(fā)現(xiàn)的功能性膜性受體G蛋白偶聯(lián)的雌激素受體（GPER）也很可能在其中發(fā)揮著不可忽視的重要作用。GPER已被證實(shí)廣泛存在于雄性泌尿生殖系統(tǒng)，包括睪丸、附睪、輸精管、精囊以及前列腺等雄性生殖器官。提示雌激素與相關(guān)受體的作用通路可

2、能是研究EEs致畸機(jī)制的關(guān)鍵。睪丸在雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育中的地位特殊，已有很多關(guān)于雌激素以及EEs直接影響睪丸發(fā)育的研究。在胚胎期，睪丸的正常發(fā)育需伴隨其自身的下降，睪丸的下降又與睪丸引帶（Gubernaculum）發(fā)育關(guān)系密切。因此從睪丸引帶角度研究EEs對(duì)睪丸乃至整個(gè)雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育的影響是一條新的途徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法研究ERα、ERβ及GPER在小鼠睪丸引帶發(fā)育過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)蛋白和基因的表達(dá)情況，以了

3、解三種雌激素受體在睪丸引帶上的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討雌激素通過(guò)睪丸引帶途徑影響睪丸下降甚至雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育的機(jī)理研究提供基礎(chǔ)。
　　材料與方法：8～10周齡SPF級(jí)昆明小鼠105只，按雌雄比例2:1合籠交配，以檢查發(fā)現(xiàn)陰道栓作為受孕標(biāo)志。發(fā)現(xiàn)陰道栓當(dāng)天定為妊娠0天，記為GD0（GD），胎鼠組分別于GD17，GD19天取材。幼鼠組待其自然分娩，以幼鼠出生當(dāng)天定為生后0天，記為PD0（PD），分別于PD0、PD3、PD7、PD14、P

4、D21取材。
　　1.取上述不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶，予固定、石蠟包埋。對(duì)包埋組織塊作2μm厚冠狀位切片并進(jìn)行組織免疫熒光染色研究，檢測(cè)睪丸引帶上三種雌激素受體蛋白的表達(dá)情況（定性、定位）。
　　2.取上述不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶，用 Trizol法提取引帶組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法鑒定 RNA完整性及純度，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)睪丸引帶上三種雌激素受體基因的表達(dá)情況（定量）。
　　結(jié)

5、果：
　　1.組織免疫熒光染色：隨著胎/小鼠天齡的增加，可見ERα、ERβ及GPER蛋白表達(dá)于不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶。①ERα嚴(yán)格表達(dá)于細(xì)胞核中，主要表達(dá)于小鼠睪丸引帶外周致密的細(xì)胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達(dá)量弱。②ERβ表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在出生前表達(dá)于小鼠睪丸引帶內(nèi)層疏松的間葉組織和外周致密的細(xì)胞區(qū)中，出生后主要表達(dá)于外周致密的細(xì)胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達(dá)量弱或不表達(dá)。③GPER表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，主要表

6、達(dá)于小鼠睪丸引帶外周致密的細(xì)胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達(dá)量弱或不表達(dá)。
　　2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：隨著胎/小鼠天齡的增加，均可檢測(cè)到ERα、ERβ及GPER基因的表達(dá)，表達(dá)不一。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如下：①ERαmRNA表達(dá)于睪丸下降的不同階段，與出生當(dāng)天（PD0）相比較，孕期表達(dá)無(wú)差異性，出生后其表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。② ERβmRNA表達(dá)于睪丸下降的不同階段，與出生當(dāng)天（PD0）相比較，孕期表達(dá)無(wú)差異性，出生后其表達(dá)量呈

7、現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。③GPER mRNA表達(dá)于睪丸下降的不同階段，與出生當(dāng)天（PD0）相比較，孕期至睪丸下降第二階段（PD7）開始時(shí)表達(dá)無(wú)差異性，第二階段開始后其表達(dá)量逐漸減弱。
　　結(jié)論：
　　1.正常小鼠睪丸引帶組織發(fā)育過(guò)程中均可檢測(cè)到ERα、ERβ及GPER蛋白及基因的表達(dá)。
　　2.免疫熒光確認(rèn)ERα在睪丸引帶細(xì)胞核上表達(dá)，ERβ在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，GPER在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，且三者主要表達(dá)于睪丸引帶外周致密

8、的細(xì)胞區(qū)中，內(nèi)層疏松的間葉組織表達(dá)量弱或不表達(dá)。
　　3.睪丸引帶組織中ERα, ERβmRNA出生后表達(dá)量逐漸下降，GPER mRNA在睪丸下降第二階段開始后表達(dá)量逐漸下降。
　　4.在介導(dǎo)睪丸下降的過(guò)程中，ERα、ERβ和GPER可能發(fā)生的作用不盡相同。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究提示不同生長(zhǎng)發(fā)育階段中小鼠睪丸引帶組織均可見ERα、ERβ、GPER的表達(dá)。這三種受體的表達(dá)呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，提示雌激素（包括外源性雌激素