二惡英對小鼠在位子宮內(nèi)膜孕酮受體亞型,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)簡稱“內(nèi)異癥”是一種雌激素依賴性良性疾病，但因其具有“轉(zhuǎn)移、侵襲”等惡性行為而被稱為"benigncancer”。其可導(dǎo)致婦女痛經(jīng)，不孕等且近年來發(fā)病率逐年上升，但到目前為止其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。眾多研究表明二惡英類與內(nèi)異癥的發(fā)生及發(fā)展有密切關(guān)系，且胎兒期的暴露有可能增加成年期的患病風(fēng)險(xiǎn)。我們先期一系列研究表明生長發(fā)育期持續(xù)暴露四氯二苯并二惡英(TCDD)可以促

2、進(jìn)小鼠子宮內(nèi)膜異位癥的形成，并且揭示了其通過對免疫系統(tǒng)，細(xì)胞因子信號通路，激素等方面的調(diào)節(jié)作用在內(nèi)異癥的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要作用，研究還發(fā)現(xiàn)了內(nèi)異癥在位子宮內(nèi)膜孕酮受體的缺乏?；騿?dòng)子區(qū)CpG島超甲基化與基因表達(dá)沉默有關(guān)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1(DNMT-1)在此過程中起到了重要作用。目前有關(guān)二惡英的研究中發(fā)現(xiàn)了其具有甲基化的調(diào)節(jié)作用。本研究的目的旨在通過探討TCDD暴露下小鼠EMS模型在位子宮內(nèi)膜孕酮受體A(PR-A)，孕酮受體B(

3、PR-B)與DNMT-1的表達(dá)及PR-A和PR-B基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度的關(guān)系，進(jìn)一步從表觀遺傳學(xué)的角度探討二惡英在內(nèi)異癥發(fā)生和發(fā)展機(jī)制中的作用。
　　 方法:
　　 1、TCDD暴露小鼠EMS模型建立
　　 將60只C57BL/6雌性小鼠與30只C3H雄性小鼠隨機(jī)合籠交配，見到陰道栓為受孕當(dāng)日，于受孕第8天將60只已孕母鼠隨機(jī)分為原對照組(TCDD:0ug/kg)和原暴露組(TCDD:3ug/kg)，原

4、對照組所產(chǎn)雌性子鼠于生后21天暴露不同劑量的TCDD并隨機(jī)分為兩個(gè)處理組分別為（生前/生后）:0/0，0/3，原暴露組所產(chǎn)子鼠選擇于生后21天暴露不同劑量TCDD并隨機(jī)分為三個(gè)處理組分別為（生前/生后）:3/0，3/3，3/10，每組均為12只。除0/0組外出生后49天每個(gè)處理組再次給予3ug/kgTCDD，生后第70天給予3ug/kgTCDD并實(shí)施自體子宮內(nèi)膜移植術(shù)構(gòu)建小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，術(shù)后3，6，9周各暴露一次TCDD(3ug

5、/kg)，術(shù)后12周取陰道脫落細(xì)胞涂片將處于動(dòng)情前期雌性子鼠脫臼處死。這樣依據(jù)雌性子代整個(gè)發(fā)育階段所暴露TCDD的劑量分為5組，分別為0/0(對照組)，0/3（青春期+成年期暴露組），3/0（胎兒期+成年期暴露組），3/3（胎兒期+青春期+成年期普通劑量暴露組），3/10(胎兒期+青春期+成年期高劑量暴露組)。
　　 2、PR-A、PR-B及DNMT-1的檢測
　　 建模術(shù)后12周將所有處理組的小鼠脫臼處死，取其在位子宮

6、內(nèi)膜組織制成蠟塊保存，本次實(shí)驗(yàn)研究用保存的蠟塊組織利用免疫組化SP法檢測在位內(nèi)膜組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-1（DNMT-1），孕酮受體A(PR-A)，和孕酮受體B(PR-B)的表達(dá)。
　　 甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測PR-A和PR-B基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化程度。
　　 3、所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析，計(jì)數(shù)資料采用Fisher確切概率法

7、，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、不同處理組小鼠在位子宮內(nèi)膜組織中DNMT-1、PR-A、PR-B的表達(dá)，各組中以上三個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)均經(jīng)過方差齊性檢驗(yàn)，符合方差分析條件，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，并采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較。
　　 DNMT-1在0/0組與0/3組中的表達(dá)經(jīng)比較無顯著性差異(P=0.189＞0.05);在0/0組與3/0組的表達(dá)經(jīng)比較無顯著性差異

8、(P=0.209＞0.05);而在0/0組與3/3組的表達(dá)經(jīng)比較具有顯著性差異(P=0.000＜0.05)，其在3/3組中的表達(dá)高于其在0/0組中的表達(dá);3/3組與3/10組的表達(dá)經(jīng)比較具有顯著性差異(P=0.000＜0.05)，其在3/10組中的表達(dá)高于其在3/3組中的表達(dá)。
　　 PR-B在0/0組與0/3組的表達(dá)經(jīng)比較無顯著性差異(P=0.156＞0.05);在0/0組與3/0組中的表達(dá)經(jīng)比較無顯著性差異(P=0.096＞

9、0.05);在0/0組與3/3組的表達(dá)經(jīng)比較具有顯著性差異(P=0.000＜0.05)，其在3/3組中的表達(dá)低于其在0/0組中的表達(dá);在3/3組與3/10組的表達(dá)經(jīng)比較具有顯著性差異(P=0.000＜0.05)，其在3/10組中的表達(dá)低于其在3/3組中的表達(dá)。
　　 各組中PR-A的表達(dá)經(jīng)比較無顯著性差異。
　　 2、各組子宮在位內(nèi)膜PR-A，PR-B基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度的比較。
　　 PR-B基因啟動(dòng)

10、子區(qū)CpG島甲基化程度0/0組與0/3組相比無顯著性差異(P=0.295＞0.05);0/0組與3/0組相比無顯著性差異(P=0.077＞0.05);而0/0組與3/3組相比有顯著性差異，且3/3組高于0/0組(P=0.014＜0.05);3/3組與3/10組相比有顯著性差異，且3/10組高于3/3(P=0.019＜0.05)。而各組中PR-A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度無顯著性差異。
　　 3、相對應(yīng)同一組別中除對照組PR-

11、A與PR-B基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度相同，而其余各組中同組PR-B基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度均高于PR-A。且相對應(yīng)同組中動(dòng)情前期小鼠子宮內(nèi)膜組織中PR-A的表達(dá)較強(qiáng)于PR-B，并隨著TCDD持續(xù)暴露劑量的增加，PR-A的表達(dá)逐漸占據(jù)更明顯的主導(dǎo)地位。
　　 結(jié)論:
　　 1、胎兒期，青春期及成年期持續(xù)暴露不同劑量TCDD有可能上調(diào)在位子宮內(nèi)膜DNMT-1的表達(dá)，下調(diào)PR-B的表達(dá)，并且隨劑量的增加其作用會增強(qiáng)

12、。對PR-A的表達(dá)卻無明顯影響。即在TCDD構(gòu)建的小鼠內(nèi)異癥模型中在位子宮內(nèi)膜組織中DNMT-1表達(dá)的增強(qiáng)主要引起PR-B表達(dá)的下降。
　　 2、胎兒期，青春期及成年期持續(xù)不同劑量TCDD的暴露有可能通過上調(diào)在位子宮內(nèi)膜DNMT-1的水平使PR-B基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島發(fā)生超甲基化改變，導(dǎo)致PR-B在組織中表達(dá)下降。而對PR-A基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化程度無影響。
　　 3、不同發(fā)育階段TCDD持續(xù)暴露潛在影響成熟期子宮