Notch信號傳導(dǎo)途徑與腫瘤基因治療相關(guān)性的研究.pdf

1、惡性腫瘤是人類死亡的主要原因之一，手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)的治療方法對腫瘤治療的效果不甚理想。從根本上來說，惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展仍然源于體內(nèi)基因表達(dá)的異常，因此，基因治療才是人類徹底征服腫瘤的希望。關(guān)于腫瘤的基因治療研究包括許多方面，其中從分子水平上徹底了解各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍然是不可逃避的問題。由于生物系統(tǒng)的高度復(fù)雜性，目前發(fā)現(xiàn)腫瘤的相關(guān)基因眾多，Notch信號傳導(dǎo)途徑也被越來越多的實(shí)驗(yàn)室證明其與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，盡管目

2、前對其本身的生物學(xué)作用尚未有個(gè)明確的定義。Notch基因編碼一個(gè)跨膜的異二聚體受體，受體激活后引起的一系列細(xì)胞內(nèi)的分子信號的改變稱為Notch途徑，正常情況下Notch途徑的功能和參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、穩(wěn)定分化和凋亡有關(guān)。近來在許多腫瘤細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Notch基因表達(dá)的失常，且失控的Notch途徑在維持腫瘤表型方面起著重要作用。本研究通過RNA干擾Notch1的方法和重組逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達(dá)Notch1活性部分的方法對。Notch途徑與不同腫瘤細(xì)

3、胞相關(guān)性作了初步探討，并利用RNA干擾的方法進(jìn)行了針對Notch1的基因治療的嘗試。 一、RNA干擾阻斷Notch途徑對腫瘤生長的影響。 本部分實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾(RNAi)的方法對一系列現(xiàn)有的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性研究，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩種siRNA分別針對PSl和Notchl蛋白，試圖在不同水平阻斷Notch信號通路以找出Notch和這些腫瘤之間的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)證明通過對PSl和Notchl的干擾能引起細(xì)胞內(nèi)Notch信號的下調(diào)，

4、并造成腫瘤細(xì)胞的增殖抑制，而對正常細(xì)胞沒有明顯的影響。細(xì)胞周期檢測發(fā)現(xiàn)增殖抑制的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的G1/S阻滯，還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的這種增殖抑制現(xiàn)象在不同細(xì)胞間也存在較大的差異，推測在不同細(xì)胞中存在著不盡相同的機(jī)制。最后選取皮下注射Hela細(xì)胞致瘤的裸鼠進(jìn)行了裸siRNA瘤內(nèi)注射的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，成功抑制了腫瘤模型的生長，是為對Notch基因用于RNA干擾基因治療的可行性研究的一次有益的嘗試。 二、外源性Notchl胞內(nèi)段的過表達(dá)對腫

5、瘤生長的影響。 本節(jié)實(shí)驗(yàn)利用帶有Notchl胞內(nèi)活性部分(ICN)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)目的細(xì)胞過表達(dá)ICN，模擬細(xì)胞Notch途徑上調(diào)的情況，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Notch信號的上調(diào)在不同腫瘤細(xì)胞中會(huì)引起不同的效應(yīng)。在Hela和HepG2細(xì)胞的MTS檢測中仍然出現(xiàn)增殖抑制，而在BGC-823細(xì)胞中，過表達(dá)的ICN則對細(xì)胞增殖起著促進(jìn)作用。除此之外，差異還表現(xiàn)在細(xì)胞早期凋亡和細(xì)胞的周期檢測上，Hela和HepG2檢測不到早期凋亡的變化，而B

6、GC-823可檢測到一定程度的早期凋亡；Hela和HepG2在細(xì)胞周期檢測中出現(xiàn)了明顯的G1/S阻滯現(xiàn)象，而BGC-823則表現(xiàn)為S期細(xì)胞顯著增加。在對Notchl和PSl的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)Notchl的過表達(dá)能引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)PSl表達(dá)的下調(diào)，而對Notchl和PSl的干擾實(shí)驗(yàn)卻都不能引起對方表達(dá)的變化，并且這一簡單的反饋機(jī)制在正常的永生化細(xì)胞中檢測不到，推測這一調(diào)節(jié)機(jī)制很可能僅存在于腫瘤細(xì)胞系中，其中的機(jī)制影響著Notch

7、信號傳導(dǎo)途徑對腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的不同作用。 三、可調(diào)控RNA干擾載體的構(gòu)建與功能研究。 利用PCR的方法從pGL3-TRTP載體上擴(kuò)增TRTP413啟動(dòng)子片斷，并替換pBSl85 CRE蛋白表達(dá)載體上的CMV啟動(dòng)子，構(gòu)建TRTP-CRE表達(dá)載體。利用受CRE重組調(diào)控的RNA干擾載體pSico和pSicoR構(gòu)建針對GAPDH和Notchl的shRNA表達(dá)載體：pSico-GAPDH、pSicoR-GAPDH、pSico