DAAO基因轉(zhuǎn)移對(duì)高成瘤性白血病細(xì)胞系K562e的殺傷作用研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文DAAO基因轉(zhuǎn)移對(duì)高成瘤性白血病細(xì)胞系K562e的殺傷作用研究姓名：翟勇平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科血液病學(xué)指導(dǎo)教師：王健民2001.5.1第二軍醫(yī)大學(xué)博士畢業(yè)論文中戈摘要血液學(xué)專業(yè)摘要(現(xiàn)代治療已明顯地改善了腫瘤的預(yù)后，但還存在毒副作用以及部分病人治療無(wú)效等問(wèn)題?；蛑委煘槟[瘤治療開(kāi)辟了新的領(lǐng)域，自殺基因編碼的前藥代謝酶能將無(wú)毒的前藥轉(zhuǎn)化成細(xì)胞致死性的藥物，將自殺基因轉(zhuǎn)八腫瘤細(xì)胞就可用前藥來(lái)特異’睦殺傷腫瘤細(xì)

2、胞。目前有希望進(jìn)入臨床應(yīng)用的自殺基因?yàn)閿?shù)不多，尋找、／百一更有效的自殺基因?qū)μ岣咧委熜Ч兄匾饬x。)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建含紅色酵母／RgracilisD氨基酸氧化酶(RG—DAAO)cDNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以高成瘤性白血病細(xì)胞系K562e為靶細(xì)胞，探討DAAO在體內(nèi)外殺傷白血病細(xì)胞的效果和機(jī)制，為DAAO基因治療腫瘤提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。，／I)AAO基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及K562e細(xì)胞轉(zhuǎn)染用BamHI酶＼切，凝膠電泳純化回收，得到線性

3、化載體pLSN片段，經(jīng)去磷酸化處理后，與PCR擴(kuò)增DAAOcDNA片段連接，經(jīng)篩選、酶切鑒定后得到含DAAO基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLDAAOSN。pLDAAOSN及另一帶綠熒光蛋白基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLDfG分別轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞oxNA，獲得具有感染能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其滴度約為52X106CFU／ml，并將所攜帶的目的基因DAAO轉(zhuǎn)移至高成瘤性人白血病細(xì)胞系K562e中獲得KDAX0、KDfG。、KD帕d等三株表達(dá)DAAO基因的K56

4、2e克隆，Kr)AA0、KDfG。、Korea細(xì)胞經(jīng)多次傳代、凍存、復(fù)蘇后進(jìn)行基因組DNA檢測(cè)、DAAOmRNA原位雜交及細(xì)胞毒性試驗(yàn)，均表明DAAO基因已穩(wěn)定整合至KDAAO、KDfG。、KD祀d細(xì)胞基因組中并表達(dá)。DAIa對(duì)轉(zhuǎn)DAAO基因的K562e細(xì)胞的殺傷效應(yīng)及機(jī)制通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、活細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察細(xì)胞生物學(xué)特性，應(yīng)用MTT法檢測(cè)D—Ala對(duì)KDAAo、Kom。、KDmd、不同比例DAAO與DAAO‘的混合細(xì)胞殺傷作用。用酚紅氧化法測(cè)

5、定培養(yǎng)上清H202。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞與K562e生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在D丙氨酸作用下形態(tài)改變，通過(guò)IVlTF法檢測(cè)其OD值，顯示DAla作用24小時(shí)后KDAAO、KDm。、KD93d細(xì)胞的IC50與K562e相差約3～lO倍，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)D—Ala敏感性明顯高于對(duì)照的K562e。同樣濃度的D—Ala延長(zhǎng)作用時(shí)間至48小時(shí)，沒(méi)有明顯提高IC50。D丙氨酸殺傷轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的作用有明顯的閾值性，達(dá)到一定有效濃度殺