TA毒素高靈敏度定量速測(cè)試劑盒研究及單克隆抗體制備.pdf

1、細(xì)交鏈格孢菌酮酸（Tenuazonic acid, TA）是鏈格孢霉毒素中毒性最強(qiáng)的一種，是鏈格孢霉，稻瘟病霉等在特定條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物之一。TA具有急性毒性、亞急性毒性、潛在致癌性和協(xié)同毒性，是鏈格孢霉毒素中關(guān)注度最高、被研究最多的一種毒素。目前TA檢測(cè)主要采用以色譜為主的儀器檢測(cè)方法，缺乏快速檢免疫檢測(cè)產(chǎn)品。本研究旨在建立快速有效的TA檢測(cè)方法和開發(fā)配套試劑盒，并利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備靈敏度高、性質(zhì)穩(wěn)定的抗TA單克隆抗體，為開

2、發(fā)更多商品化的TA免疫檢測(cè)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。
　　本研究利用肟化法和活潑酯法合成人工抗原，經(jīng)過動(dòng)物免疫制備抗TA多克隆抗體。利用多克隆抗體建立間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（ Indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay, icELISA）及將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和免疫反應(yīng)相結(jié)合的間接競爭化學(xué)發(fā)光免疫法（ Indirect competition chemiluminescence en

3、zyme immunoassay, icCLEIA），通過對(duì)方法的重要影響因素研究，研制組裝了配套試劑盒。在多克隆抗體制備技術(shù)的基礎(chǔ)上，將能產(chǎn)生抗TA多克隆抗體的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP0/2）進(jìn)行細(xì)胞融合制備雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)亞克隆培養(yǎng)篩選出5株特異、穩(wěn)定分泌抗TA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，選擇其中性狀最好的一株細(xì)胞通過體內(nèi)誘生腹水的方法制備大量抗TA單克隆抗體，為批量生產(chǎn)性質(zhì)穩(wěn)定的免疫檢測(cè)產(chǎn)品提供抗體保證。主要研究結(jié)果如下：

4、r>　?。?）建立icELISA檢測(cè)方法并開發(fā)ELISA試劑盒。研究icELISA的包被濃度、包被時(shí)間、封閉液種類、抗血清稀釋度、競爭反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋度、二抗反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間等條件，確定其最佳反應(yīng)條件為：包被濃度2.5μg/mL、37℃包被1 h、5％脫脂奶粉封閉、抗血清稀釋64000倍、競爭反應(yīng)30 min、二抗稀釋6000倍、二抗反應(yīng)時(shí)間60 min、顯色15 min。方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-21.65x+53.68（R2=0

5、.9941），IC50為1.48 ng/mL，最低檢出限（Limt of detection, LOD）為0.02 ng/mL，檢測(cè)范圍0.06~35.95 ng/mL，回收率范圍81.59%~91.52%。ELISA試劑盒批內(nèi)變異系數(shù)為2.48%，批間變異系數(shù)為9.49%；未完全密封時(shí)4℃至少保存60 d；該試劑盒與黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）、T-2毒素（T

6、-2 toxin, T-2）、展青霉毒素（Patulin, PAT）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Desoxynivalenol, DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）和交鏈孢酚（Alternariol, AOH）的交叉反應(yīng)率均小于1%，說明該試劑盒特異性好，與其他毒素不發(fā)生交叉反應(yīng)。
　?。?）建立icCLEIA檢測(cè)方法并開發(fā)CLEIA試劑盒。研究icCLEIA的緩沖液pH值、包被濃度、封閉液種類、抗血清稀釋度、競

7、爭反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋度和發(fā)光底物添加量等條件，確定icCLEIA的最佳工作條件為：緩沖液pH范圍6.4~7.4，包被濃度2.0μg/mL、封閉液1%OVA、抗血清稀釋80000倍，競爭反應(yīng)30 min、酶標(biāo)二抗稀釋度8000倍、發(fā)光底物添加量為125μL/孔。方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=49.82-20.14x(R2=0.9966），IC50為0.973 ng/mL，LOD為0.010 ng/mL，在相同試劑條件下特異性和方法靈敏度均高于i

8、cELISA，適合低濃度TA檢測(cè)；檢測(cè)范圍0.032~30.244 ng/mL，回收率81.53%~96.09%。試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)為4.08%，批間變異系數(shù)為8.91%；未密封的試劑盒在4℃下可至少保存90 d。試劑盒與AFB1、OTA、PAT、DON、ZEN和AOH的交叉反應(yīng)率均小于1%，說明試劑盒特異性好，沒有交叉反應(yīng)。
　　（3）小鼠骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合后，經(jīng)亞克隆培養(yǎng)篩選5株陽性細(xì)胞株。細(xì)胞株分別命名為TAO-4A1

9、、TAO-4D5、TAO-4F4、TAO-7F11和TAO-7G11。將TAO-4F4細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后通過體內(nèi)腹水誘生制備抗TA單克隆抗體。腹水經(jīng)蛋白A層析法純化后得到單克隆抗體，濃度為0.40 mg/mL。純化的單克隆抗體具有50 KDa和25 KDa的重鏈和輕鏈，沒有雜蛋白。icELISA結(jié)果表明單克隆抗體的IC50為6.1 ng/mL?？筎A單克隆抗體IC50與提供脾細(xì)胞的小鼠多克隆抗體（IC50為420 ng/mL）相比降低約6