人誘導(dǎo)共刺激分子配體ICOSL單克隆抗體及ELISA試劑盒的研制及應(yīng)用.pdf

1、T細(xì)胞活化需要雙信號：第一信號是TCR(T cell receptor)識別抗原提呈細(xì)胞表面抗原肽-MHC復(fù)合物，第二信號是T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞共刺激分子之間的互相作用，共同決定T細(xì)胞的活化增殖，維持并調(diào)節(jié)活化級聯(lián)反應(yīng)，抑或轉(zhuǎn)變?yōu)闊o反應(yīng)狀態(tài)甚至凋亡。正性共刺激分子ICOS（inducible costimulator）與其配體ICOSL（inducible costimulator ligand）相互作用后能有效地促進(jìn)T細(xì)胞的增殖、活化

2、和細(xì)胞因子的分泌等，還會參與Tfh（T follicular helper cells）增殖分化和生發(fā)中心反應(yīng)，從而對B細(xì)胞分泌抗體發(fā)揮作用。同時ICOS/ICOSL信號通路在自身免疫性疾病、移植免疫、腫瘤免疫乃至感染性免疫的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的生物學(xué)功能。
　　正性共刺激分子ICOSL以兩種形式存在：可溶型和膜型。膜型ICOSL分子一定程度表達(dá)在活化的B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和部分T細(xì)胞亞群，也可誘導(dǎo)表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、

3、上皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞上。ICOSL與其表達(dá)在T細(xì)胞上的受體ICOS結(jié)合，可以不依賴于B7/CD28通路作用于T細(xì)胞發(fā)揮功能。ICOS分子胞內(nèi)段含有一個“YMFM”基序，可與PI3K結(jié)合發(fā)揮其激酶活性，作用于下游信號通路，即ICOS/ICOSL信號途徑會激活T細(xì)胞內(nèi)依賴PI3K的信號途徑。一般情況下可溶性共刺激分子可以通過專一的mRNA編碼經(jīng)免疫細(xì)胞直接分泌產(chǎn)生，也可以由膜型分子經(jīng)蛋白水解酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶等）的裂解而形成。臨床資料分析

4、顯示，部分可溶性共刺激分子具有臨床診斷的價值，然而機(jī)體中是否存在可溶性 ICOSL，它是通過何種機(jī)制產(chǎn)生的，表達(dá)特性如何，在對膜型ICOS/ICOSL的調(diào)節(jié)作用中扮演何種角色，在臨床疾病的免疫病理中發(fā)揮何種生物學(xué)作用等，這些問題還有待研究。因此，ICOS/ICOSL信號通路對T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。通過研究ICOS/ICOSL的表達(dá)及其介導(dǎo)的信號通路與臨床疾病的關(guān)系，闡明其在免疫病理中的作用和機(jī)理，可以為某些疾病的

5、免疫診斷和免疫治療尋求新的途徑。
　　本課題研究旨在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/ICOSL的基礎(chǔ)上，研制出特異性的鼠抗人ICOSL單克隆抗體，同時分析其生物學(xué)特性，進(jìn)一步探究單抗對ICOS/ICOSL途徑的調(diào)節(jié)作用和對T細(xì)胞增殖及其細(xì)胞因子分泌的影響；并應(yīng)用所得單抗研制特異性檢測人可溶性ICOSL(sICOSL)的ELISA試劑盒，對試劑盒的精確性和穩(wěn)定性進(jìn)行評價；利用研制的ELISA試劑盒檢測健康志愿者和系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血可溶

6、性ICOSL的表達(dá)水平，探究sICOSL可能的產(chǎn)生機(jī)制，進(jìn)而探討該可溶性因子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫病理中的臨床意義。上述研究結(jié)果為闡明膜型ICOSL和可溶型ICOSL的生物學(xué)意義及ICOS/ICOSL在自身免疫性疾病中的作用提供了新的線索。
　　一、鼠抗人ICOSL單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究
　　【目的】研制特異性鼠抗人ICOSL單克隆抗體，為探究人ICOSL分子在不同細(xì)胞上或多種疾病中的表達(dá)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，并為探討I

7、COS/ICOSL信號通路的生物學(xué)意義提供物質(zhì)材料。
　　【方法】以高表達(dá)人ICOSL分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞L929/ICOSL免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行融合，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行初篩，將合格的雜交瘤細(xì)胞株反復(fù)檢測和亞克隆，成功獲得兩株特異性好且能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人ICOSL單抗的雜交瘤細(xì)胞株；采取CBA法和快速定性試紙法鑒定抗體亞型；通過Western blot

8、、Dot blot、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)和ELISA以及兩株單抗之間或單抗與蛋白之間的競爭結(jié)合抑制實驗分析所得單抗的生物學(xué)特性；用流式細(xì)胞術(shù)和間接免疫熒光分析ICOSL在多種腫瘤細(xì)胞表面的表達(dá)水平；研究所得單抗在人T細(xì)胞體外增殖實驗中的生物學(xué)功能。
　　【結(jié)果】1、成功獲得兩株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人ICOSL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株：13D11和20B10。這兩株單抗可用于流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、Dot blot、ELIS

9、A、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)的檢測分析；2、競爭抑制實驗表明，兩株單抗識別ICOSL分子不同的抗原表位，且都與商品化單抗2D3不同；兩株單抗均能有效阻斷ICOS/ICOSL的結(jié)合；3、T細(xì)胞體外增殖實驗結(jié)果表明，單克隆抗體13D11可抑制活化T細(xì)胞的體外增殖，且其抑制作用隨單抗?jié)舛鹊脑黾佣鰪?qiáng)。
　　【結(jié)論】成功獲得兩株特異性鼠抗人ICOSL單克隆抗體，兩者識別ICOSL不同的抗原表位，為研制檢測人可溶性ICOSL的ELISA試劑盒，進(jìn)一

10、步用來測定可溶性ICOSL的表達(dá)水平奠定了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)；也為分析膜型ICOSL的表達(dá)特性，探討ICOS/ICOSL信號通路對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及其生物學(xué)功能提供必要的物質(zhì)材料。
　　二、特異性檢測人可溶性ICOSL蛋白ELISA試劑盒的研制
　　【目的】研制穩(wěn)定靈敏的特異性檢測人sICOSL的ELISA試劑盒，為定量分析臨床來源的標(biāo)本和研究可溶性ICOSL的生物學(xué)意義提供有潛在應(yīng)用價值的檢測試劑。
　　【方法】運(yùn)用ant

11、i-ICOSL mAb（20B10）作為包被抗體，在包被液（即碳酸鹽緩沖液）中包被ELISA板，4℃避光過夜，biotin-anti-ICOSL mAb（2B4）作為檢測抗體，識別已與20B10相結(jié)合的抗原，再加入Streptavidin-HRP反應(yīng)，最后用TMB底物顯色，即雙抗體夾心法建立sICOSL的ELISA檢測體系。利用同一次實驗多孔檢測的方法分析試劑盒的精確性，利用同一次實驗ELISA板的不同測定時間的準(zhǔn)確性分析試劑盒穩(wěn)定性。

12、
　　【結(jié)果】建立穩(wěn)定、靈敏的特異性檢測人sICOSL的ELISA試劑盒，且試劑盒能特異性測定人sICOSL，而不識別其他蛋白，試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線在sICOSL蛋白0.156~10ng/ml的范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。這種方法有良好的精確性和穩(wěn)定性，離散度（CV％）分別為<10.9%和<3.65%。
　　【結(jié)論】研制出特異性檢測人sICOSL的 ELISA試劑盒，為定量分析可溶性ICOSL的生物學(xué)功能和臨床價值提供了有效的檢

13、測手段。
　　三、可溶性ICOSL的表達(dá)特性及其在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的臨床意義
　　【目的】檢測健康人外周血中sICOSL的表達(dá)水平，揭示機(jī)體sICOSL的產(chǎn)生機(jī)制，探討sICOSL在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血異常表達(dá)的臨床意義。
　　【方法】應(yīng)用第二部分研制的特異性檢測人sICOSL的ELISA試劑盒分析各年齡層健康志愿者外周血中sICOSL的表達(dá)特性；在高表達(dá)可溶性ICOSL的L929/ICOSL細(xì)胞培養(yǎng)液中

14、加入金屬蛋白酶抑制劑（MMPI），設(shè)空白對照，在不同時間點(diǎn)分析sICOSL的表達(dá)水平；人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）加磁珠分選獲得CD14+單核細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞，加入MMPI，同時設(shè)空白對照，體外刺激活化后，運(yùn)用ELISA和流式檢測可溶型和膜型ICOSL的表達(dá)水平，ELISA檢測培養(yǎng)上清中可溶性MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。流式檢測45例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和39例健康志愿者(Healthy control,HC)外周血CD4

15、+、CD8+T細(xì)胞表面ICOS及CD14+單核細(xì)胞、CD19+B細(xì)胞表面ICOSL的表達(dá)特性；利用自主研制的sICOSL ELISA試劑盒分析血漿可溶性ICOSL的表達(dá)。用統(tǒng)計學(xué)軟件將測得的數(shù)據(jù)與臨床各項指標(biāo)作相關(guān)性分析，評價其臨床意義。
　　【結(jié)果】1、ELISA檢測結(jié)果顯示，sICOSL存在于人外周血中，且表達(dá)水平與年齡、性別有一定的相關(guān)性；2、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（MMPI）能抑制L929/ICOSL轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或過度活化的

16、CD14+單核細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞培養(yǎng)上清中sICOSL的表達(dá)，且與對照組相比，實驗組MMP-2和MMP-9的表達(dá)下調(diào)；3、與健康對照（HC）相比，SLE患者外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞表面ICOS的表達(dá)均顯著升高（19.07±1.74）%vs（13.99±1.54）%、（10.04±0.99）%vs（6.36±0.99）%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），CD14+單核細(xì)胞上ICOSL的表達(dá)高于健康對照[（2.94±0.88）

17、%vs（0.89±0.21）%，（P=0.04）]，且與患者血漿C3和C4水平呈正相關(guān)[(r=0.40，P=0.031)，(r=0.44，P=0.017)]。活動期組SLE患者血漿sICOSL的濃度顯著高于非活動期組[(361.5±25.28)(ng/ml)vs(278±14.75)(ng/ml)，(P=0.025)]，且與CD14+單核細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞表面ICOSL的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)[(r=-0.4243，P=0.022)、(r=

18、-0.4099，P=0.025)]。
　　【結(jié)論】人外周血中存在可溶性ICOSL，且MMP是其可能的產(chǎn)生機(jī)制之一。SLE患者外周血淋巴細(xì)胞表面ICOS和ICOSL以及血漿sICOSL表達(dá)水平顯著增加，且與疾病活動度密切相關(guān)。提示ICOS/ICOSL途徑可能參與SLE免疫病理過程。
　　綜上所述，本研究獲得以下結(jié)果：（1）研制出2株鼠抗人ICOSL單克隆抗體，可用于流式細(xì)胞術(shù)、Western blot、Dot blot和ELI

19、SA等研究；功能性鼠抗人ICOSL單抗13D11能抑制ICOS/ICOSL介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的分泌。（2）建立了特異性檢測人sICOSL的ELISA方法，而且這個方法具有良好的精確性和穩(wěn)定性。（3）利用研制的sICOSL ELISA試劑盒分析表明，健康人外周血中存在sICOSL，且金屬蛋白酶（MMPs）剪切機(jī)制是sICOSL的產(chǎn)生機(jī)制之一；SLE患者外周血淋巴細(xì)胞表面ICOS和ICOSL及血漿sICOSL均表達(dá)異常，并且與疾病活