鄰苯二甲酸單甲酯單克隆抗體的制備及試劑盒的研制.pdf

1、鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)是聚氯乙烯等塑料制品的增塑劑成分，同時它還是紡織纖維類潤滑劑及膠粘合劑的重要工業(yè)原料。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，塑料制品的用途日益廣泛，塑料、紡織纖維和粘合劑等這些材料又是我們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｒ娙沼闷?，因此，PAEs在現(xiàn)代生活中隨處可見。由于PAEs具有很難被分解和累積效應(yīng)的特點而通過食物鏈和水循環(huán)而進入環(huán)境中。臺灣的增塑劑風(fēng)波使得更多的人們非常關(guān)注PAEs。研究發(fā)現(xiàn)，PAEs為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有生殖毒性、致

2、癌、致畸等遺傳毒性，因而各國均加強了對該物質(zhì)的檢測力度。
　　目前，PAEs常用的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用等，這些方法均能在一定濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)對PAEs的檢測，但是使用上述這些方法進行檢測時大多要對樣品進行處理，且檢測的過程復(fù)雜，費時費事，成本較高，靈敏度較低。因此，建立一種省時省力、成本較低的檢測方法迫在眉睫。
　　酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測具有對檢測樣品的專一性，同時樣品處理過程較為簡單，

3、檢測成本較低，可以一次性檢測多個樣品，且靈敏度高。因此，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)能很好地解決上述物理、化學(xué)檢測中存在的這些問題，但是ELISA檢測的關(guān)鍵問題是首先要有PAEs相應(yīng)的抗體。
　　鄰苯二甲酸單甲酯(MMP)是PAEs中的一種，為建立MMP的ELISA檢測方法，本研究以4-硝基鄰苯二甲酸酐和甲醇為原料合成4-氨基鄰苯二甲酸單甲酯，即半抗原，通過化學(xué)偶聯(lián)方法將半抗原分別連接載體蛋白OVA和BSA，得到人工抗原MMAP-O

4、VA，MMAP-BSA，MMCP-OVA，MMCP-BSA。將人工抗原對小鼠進行免疫，同時進行效價及抑制率的測定，通過細胞融合的方法制備雜交瘤細胞，對融合細胞進行篩選及克隆化，建立MMP單克隆細胞株，制備MMP單克隆抗體并利用該抗體進行試劑盒的研制。
　　研究結(jié)果表明:通過采用紫外光譜法和SDS-PAGE法鑒定人工抗原的合成時成功的。在第五次免疫后對小鼠的血清進行測定，測得MMCP-BSA組小鼠的效價均達到了105以上，達到了免疫

5、的要求。對該組小鼠的血清采用間接競爭ELISA法測得IC50為115μg/L。以上結(jié)果顯示小鼠免疫效果良好，符合細胞融合的要求。通過細胞融合和對雜交瘤細胞的篩選試驗獲得一株能穩(wěn)定分泌抗體的細胞株。對該細胞株進行染色體分析得到其染色體條數(shù)為97～103條，證明該融合是成功的。對該抗體進行性質(zhì)鑒定測得其蛋白質(zhì)含量為3.75 mg/mL。在抗體制備成功的基礎(chǔ)上進行試劑盒的制備，采用間接競爭法測得當(dāng)MMP濃度在10.43～264.72μg/L時