肺癌轉(zhuǎn)移模型建立及LacZ基因轉(zhuǎn)染EPCs檢測.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定的人肺腺癌裸鼠移植瘤肺轉(zhuǎn)移模型；探索更加成熟的人骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外條件下分離、傳代、擴(kuò)增的方法；觀察重組腺病毒Ad5F35-LacZ在EPCs中的表達(dá)。 方法：①選取肺腺癌細(xì)胞株SPC-A1，體外傳代擴(kuò)增至一定數(shù)目后接種于裸鼠腹股溝皮下，觀察移植瘤的生長情況，于移植后第4、6、8、10、12、14周分別處死一組裸鼠，摘取肺、肝、腎器官，中性緩沖福爾馬林固定、石蠟包埋后連續(xù)切片，HE染色，顯微鏡下觀察各臟器腫

2、瘤轉(zhuǎn)移情況。②無菌條件下采集人骨髓，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞接種于EBM-2培養(yǎng)液，37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，挑選不同形態(tài)的細(xì)胞集落分別傳代擴(kuò)增。采用免疫組織化學(xué)方法，檢測細(xì)胞表面抗原CD31、CD34、vWF、KDR的表達(dá)，最終確認(rèn)EPCs。③體外傳代擴(kuò)增EPCs，采用Ad5F35-LacZ基因轉(zhuǎn)染EPCs，觀察LacZ基因的表達(dá)。 結(jié)果：①裸鼠接種SPC-A1細(xì)胞后一周后局部出現(xiàn)肉眼可見的腫物，腫物生長迅速，1

3、0周后進(jìn)入平臺(tái)期。顯微鏡下觀察第4周、第6周肺臟、肝臟病理切片均未見轉(zhuǎn)移灶。第8周開始肺部出現(xiàn)小轉(zhuǎn)移灶，以后轉(zhuǎn)移灶數(shù)目逐漸增多，其間可見有小血管生成。第12周至第14周部分裸鼠出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移。整個(gè)觀察過程中腎臟未見肉眼及鏡下轉(zhuǎn)移灶。②人骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞在EBM-2培養(yǎng)液中生長良好，培養(yǎng)過程中出現(xiàn)兩種形態(tài)的細(xì)胞：一類為纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞，呈長梭形，細(xì)胞增殖迅速；另一類為類圓形或短梭形細(xì)胞，呈“鋪路石”樣排列，表面抗原進(jìn)行檢測，其表達(dá)CD3

4、1、CD34、vWF、KDR。而纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞除表達(dá)vWF外，其余均為陰性，據(jù)此結(jié)果可確認(rèn)“鋪路石”樣排列的細(xì)胞為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，即EPCs。EPCs可穩(wěn)定傳至7~8代，每傳一代細(xì)胞可增殖2~3倍，細(xì)胞在8代以后逐漸出現(xiàn)老化，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多，增殖能力下降。③Ad5F35-LacZ基因轉(zhuǎn)染EPCs，72h后大部分細(xì)胞表達(dá)LacZ基因并合成半乳糖苷酶，X-gal染色呈藍(lán)色。在一定范圍內(nèi)EPCs轉(zhuǎn)染率隨MOI值增大而升高。 結(jié)