5-Aza-dC在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)喉癌細(xì)胞MYCT1-TV基因表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、前言:
　　 喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。其病理類型主要為喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)。近年來(lái),喉癌的發(fā)病率逐步上升。我國(guó)東北地區(qū)喉癌發(fā)病率居于頭頸部腫瘤首位。喉癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究將為喉癌的預(yù)防和基因診治提供重要的分子靶標(biāo)。
　　 腫瘤抑制基因(TSG)的失活在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化可引起TSG表達(dá)沉默,使細(xì)胞出現(xiàn)無(wú)節(jié)制生長(zhǎng),導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　 5-氮-2'-脫氧胞苷

2、(5-Aza-dC)是一種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑,其通過(guò)去甲基化作用使因?yàn)镃pG島甲基化而失活的TSG重新表達(dá),獲得腫瘤抑制功基因功能。
　　 在前期工作中,我們應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)發(fā)現(xiàn)喉癌基因MYCT1的一個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本,命名為MYCT1-TV。RT-PCR結(jié)果顯示,該基因在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著低于正常細(xì)胞系,在喉癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織。轉(zhuǎn)染MYCT1-TV-GFP表達(dá)載體的Hep2細(xì)

3、胞存活率下調(diào),凋亡率增高,細(xì)胞侵襲能力降低,揭示MYCT1-TV可能具有TSG特性。利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)、凝膠電泳遷移率分析(EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)癌基因c-Myc通過(guò)結(jié)合MYCT1-TV啟動(dòng)子區(qū)E-box元件而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。亞硫酸鹽測(cè)序PCR(BisulritesequencingPCR,BSP)檢測(cè)結(jié)果顯示MYCT1-TV啟動(dòng)子區(qū)E-box元件中CpG的胞嘧啶均被甲基化(文章已被接收,B

4、MCCancer,2012)。我們推測(cè)MYCT1-TV啟動(dòng)子區(qū)E-box元件甲基化將干擾其與c-Mvc的結(jié)合。
　　 在本項(xiàng)目中,我們擬應(yīng)用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮-2'-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對(duì)喉癌Hep2細(xì)胞進(jìn)行去甲基化處理,通過(guò)半定量RT-PCR和qPCR、BSP和ChIP實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)處理前后MYCT1-TV基因轉(zhuǎn)錄水平、E-box序列的甲基化狀態(tài)和E-box元件與c-Myc結(jié)合能力的變化;另一方面,通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)

5、檢測(cè)啟動(dòng)子E-box元件甲基化狀態(tài)對(duì)其與轉(zhuǎn)錄因子c-Myc結(jié)合能力的影響。
　　 材料與方法:
　　 5-Aza-dC(4μmol/L)處理喉癌Hep2細(xì)胞,利用RT-PCR和qPCR檢測(cè)處理前后MYCT1-TV基因的mRNA表達(dá)水平,BSP檢測(cè)處理后E-box序列的甲基化狀態(tài)。利用EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)甲基化對(duì)MYCT1-TV基因與轉(zhuǎn)錄因子c-Myc結(jié)合能力的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 1、5-

6、Aza-dC處理前后喉癌Hep2細(xì)胞中MYCT1-TV基因與beta-actinmRNA表達(dá)水平的灰度值之比分別為0.2085±0.0234和1.2821±0.04,差異具有顯著性(P＜0.05);MYCT1-TV基因與GAPDHmRNA表達(dá)水平的kQ值之比分別為1±0.2450和6.11±0.4582,差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 2、BSP結(jié)果顯示5-Aza-dC處理后喉癌Hep2細(xì)胞中MYCT1-TV基因E-bo

7、x序列發(fā)生去甲基化。
　　 3、EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MYCT1-TV基因E-box序列甲基化特異性探針與核蛋白有微弱的結(jié)合,提示E-box序列甲基化干擾了MYCT1-TV基因與c-Myc的結(jié)合。
　　 4、ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5-Aza-dC處理Hep2細(xì)胞后E-box序列與c-Myc結(jié)合能力較處理前顯著增強(qiáng),處理前后E-box與Input灰度值之比分別為0.1391±0.0225和0.4964±0.0134,差異具有顯