難治性癲癎患者致癎灶細(xì)胞凋亡現(xiàn)象及機制的研究.pdf

1、癲癎是當(dāng)今世界上的一種嚴(yán)重腦部疾病，中國癲癎患病率為7‰，全國有癲癎病人800多萬，且以每年27萬的速率增長。它是一種慢性腦部疾患，具有突發(fā)性和反復(fù)性的特點，以腦部神經(jīng)元過度放電引起突然反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征。目前其發(fā)病機制和進(jìn)展過程仍有待進(jìn)一步研究。近年來，癲癎研究領(lǐng)域的細(xì)胞凋亡學(xué)說受到越來越多的關(guān)注。普遍認(rèn)為神經(jīng)元凋亡在癲癎的發(fā)生和發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用。對難治性癲癎患者手術(shù)切除致癎灶腦組織標(biāo)本的研究將有助于探索癲

2、癎的發(fā)病機制，從而為臨床新療法提供理論依據(jù)。 目的:細(xì)胞凋亡主要是指在一定的生理或者病理刺激下遵循自身程序發(fā)生的細(xì)胞死亡，由于凋亡是通過細(xì)胞內(nèi)特殊基因程序而發(fā)生的，故又稱之為程序性死亡(PCD)。本研究通過觀察難治性癲癎患者手術(shù)切除癲癎灶中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，探討神經(jīng)元凋亡在癲癎發(fā)病機制中的意義。線粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，生命體內(nèi)90％以上ATP是由線粒體產(chǎn)生。在細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑中，線粒體起著中心調(diào)控作用，在某種意義上線粒體

3、可以決定細(xì)胞生存與死亡。本實驗擬對線粒體途徑進(jìn)行研究，探討內(nèi)源性凋亡途徑在癲癎發(fā)生和發(fā)展中的作用，為臨床預(yù)防和治療癲癎提供思路與依據(jù)。 方法:收集經(jīng)手術(shù)治療的難治性癲癎患者致癎灶標(biāo)本，以經(jīng)手術(shù)治療的非癲癎患者腦組織標(biāo)本做為對照，對臨床資料全面分析的基礎(chǔ)上，應(yīng)用光鏡、電鏡及凋亡細(xì)胞DNA原位末端標(biāo)記法(TUNEL)觀察標(biāo)本中存在的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，對致癎灶神經(jīng)元和TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù)并加以比較。在第一階段實驗的基礎(chǔ)上，繼續(xù)收集難治性

4、癲癎患者手術(shù)切除標(biāo)本，應(yīng)用透射電鏡觀察神經(jīng)元線粒體形態(tài)。通過離心將腦組織標(biāo)本中線粒體與胞漿分離，隨后利用線粒體膜電位熒光探針和分光光度法分析線粒體膜電位，利用westernblot方法檢測胞漿內(nèi)細(xì)胞色素C和Caspase-3蛋白的含量，并進(jìn)行比較和半定量分析。免疫組織化學(xué)染色檢測組織細(xì)胞內(nèi)Bcl-2、Bax的含量。所有統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件完成。 結(jié)果:光鏡下致癎灶神經(jīng)元固縮、減少，反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生。用TUNEL方

5、法檢測，可見凋亡細(xì)胞核呈棕色著染，陽性細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞縮小，出現(xiàn)胞周間隙；對照組中神經(jīng)元數(shù)量、形態(tài)基本正常，TUNEL陽性細(xì)胞罕見。難治性癲癎組神經(jīng)元計數(shù)明顯少于對照組；TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著增高。電鏡下，癲癎組標(biāo)本中觀察到典型神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象，染色質(zhì)濃縮，邊集于核膜，成境界清楚的塊狀，細(xì)胞核固縮，核仁消失，神經(jīng)元周圍樹突水腫，可見凋亡小體；神經(jīng)元線粒體普遍腫脹，特別在嵴的部位更為明顯，部分標(biāo)本可

6、見線粒體膜破壞；線粒體膜電位的比較發(fā)現(xiàn)，癲癎組熒光強度高于對照組，二者差異顯著；westernblot顯示胞漿Cyt-C和Caspase-3蛋白增多，與對照組存在顯著差異；免疫組化染色顯示，Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)陽性神經(jīng)細(xì)胞呈棕黃色著染，染色主要位于胞漿，與對照組比較，癲癎組Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞數(shù)量均顯著增多。 結(jié)論: (1)難治性癲癎患者致癎灶存在細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，神經(jīng)元凋亡可能參與癲癎的發(fā)病和進(jìn)展過程；