顳葉癲癎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭屑毙院瓦t發(fā)性神經(jīng)元變性的特征及機(jī)制研究.pdf

1、顳葉癲癇是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其長(zhǎng)期的病理變化很多仍不清楚，這也是顳葉癲癇患者臨床治療的嚴(yán)重障礙。癲癇發(fā)生過(guò)程通常包括三個(gè)階段：損傷→潛伏期階段（致癎期）→自發(fā)性癲癇發(fā)作（癥狀性癲癇）。雖然癲癇發(fā)生和反復(fù)發(fā)作的機(jī)制在顳葉癲癇患者中很難了解，但是在動(dòng)物的顳葉癲癇模型中獲得了越來(lái)越多的資料。在嚙齒類動(dòng)物中通過(guò)匹羅卡品注射誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)(statusepilepticus,SE)已廣泛用于慢性癲癇的實(shí)驗(yàn)研究。在大鼠或小鼠中系統(tǒng)應(yīng)用匹羅卡

2、品誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元丟失與顳葉癲癇患者的情況相似。
　　顳葉癲癇模型中有兩種主要的神經(jīng)元死亡機(jī)制。一種機(jī)制是急性死亡，與水腫或缺血有關(guān)。另一種機(jī)制是遲發(fā)性死亡，可能由細(xì)胞內(nèi)濃度短暫性異常升高的游離鈣介導(dǎo)，這也許會(huì)過(guò)度激活各種在正常情況下參與突觸可塑性的酶系統(tǒng)如鈣蛋白酶和蛋白激酶，caspases介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡(programmedcelldeath,PCD)可能在遲發(fā)性損傷中起作用。神經(jīng)元丟失是致癎期間環(huán)路重組的主要因

3、素之一，因此損傷因素如SE發(fā)作誘導(dǎo)的細(xì)胞受損程度和時(shí)程仍是非常需要闡明的重要問題，因?yàn)檫@也許是慢性癲癇中發(fā)生長(zhǎng)期病理變化和反復(fù)癲癇發(fā)作的關(guān)鍵性神經(jīng)基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡是慢性癲癇發(fā)生中神經(jīng)元丟失的原因之一。凋亡是機(jī)體在一定的生理或病理?xiàng)l件下通過(guò)啟動(dòng)多種機(jī)制如死亡信號(hào)受體、線粒體功能障礙、caspase酶激活及DNA破壞而進(jìn)行的程序性死亡過(guò)程。進(jìn)一步闡明凋亡在慢性癲癇發(fā)生過(guò)程所起的作用仍然非常重要。
　　研究目的：本研究旨在闡明顳葉癲癇中可

4、能發(fā)生的長(zhǎng)期腦損傷特征及損傷的相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：我們?cè)陲D葉癲癇的小鼠匹羅卡品模型中通過(guò)Fluoro-JadeC(FJC)染色方法探測(cè)了變性神經(jīng)元的區(qū)域分布和時(shí)程變化，還結(jié)合免疫熒光技術(shù)闡明了受累神經(jīng)元的類型及涉及的損傷機(jī)制。FJC是一種新發(fā)展的熒光染料，對(duì)正發(fā)生變性的神經(jīng)元（包括胞體、樹突、軸突和軸突末梢）有高度的親和力，特異性標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)正發(fā)生變性的神經(jīng)元。
　　研究結(jié)果：(1)在本研究中，我們用FJC染色方法

5、結(jié)合標(biāo)記神經(jīng)元核特異性蛋白(neuronalnuclearspecificprotein,NeuN)的免疫熒光技術(shù)揭示匹羅卡品誘發(fā)的SE導(dǎo)致了從嗅球到中腦的許多腦區(qū)發(fā)生了大量的神經(jīng)元細(xì)胞變性。(2)而且，由FJC揭示的神經(jīng)元變性（包括急性和遲發(fā)性神經(jīng)元損傷）是時(shí)間依賴性的。FJC陽(yáng)性神經(jīng)元在SE后4h出現(xiàn)，在12h-3d時(shí)達(dá)到高峰，然后又逐漸下降，7-14d時(shí)在有些區(qū)域甚至恢復(fù)到基線水平或消失。(3)雙標(biāo)記資料揭示FJC與Hoechst

6、33342雙標(biāo)，且大多數(shù)FJC陽(yáng)性神經(jīng)元也表達(dá)凋亡信號(hào)因子如cytochromeC、caspase-9和活化的caspase-3，提示這些FJC陽(yáng)性神經(jīng)元正經(jīng)歷凋亡過(guò)程且可能尚處于早期階段，也可能提示caspases介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡在遲發(fā)性損傷中起重要作用。(4)更有趣的是，大部分（88％）FJC陽(yáng)性神經(jīng)元顯示GABA(gamma-aminobutyricacid)能性質(zhì)，因?yàn)樗鼈円矊?duì)谷氨酸脫羧酶-67(glutamicacidde

7、carboxylase-67,GAD-67)顯示免疫反應(yīng)性，這也許提示在小鼠的匹羅卡品模型中GABA能神經(jīng)系統(tǒng)的抑制功能受到嚴(yán)重?fù)p害。
　　結(jié)論：本研究首次在小鼠匹羅卡品癲癇模型中應(yīng)用FJC染色技術(shù)探測(cè)神經(jīng)元死亡的區(qū)域分布、時(shí)程變化及相關(guān)機(jī)制。結(jié)合以前的研究綜合考慮，在小鼠匹羅卡品顳葉癲癇模型中通過(guò)FJC標(biāo)記變性的GABA能神經(jīng)元的時(shí)程變化情況及所揭示的神經(jīng)元死亡機(jī)制不僅有利于更好地理解顳葉癲癇中所發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)長(zhǎng)期病理變化和