慢性粒細(xì)胞白血病患者SHIP基因及4EBP1基因的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的:慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種發(fā)生在多能造血干細(xì)胞上的惡性骨髓增生性疾病，是一種慢性骨髓增殖性腫瘤，絕大多數(shù)的患者有特異性Ph染色體形成BCR/ABL融合基因，基因編碼蛋白的絡(luò)氨酸激酶活性顯著增強(qiáng)，激活癌基因影響細(xì)胞增殖分化、凋亡、抑制正常造血而發(fā)病。絡(luò)氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是針對(duì)BCR/ABL融合基因的靶向治療藥物，但是有部分患者出現(xiàn)耐藥。SHIP基因主要表達(dá)于造血系統(tǒng)

2、中，是造血系統(tǒng)的重要負(fù)調(diào)控因子，通過(guò)抑制PI3K/Akt通路發(fā)揮其作用。本課題意義在于進(jìn)一步研究SHIP基因在白血病發(fā)病中的機(jī)理，為尋找白血病治療的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　SHIP(SH2-containing inositol polyphosphate5-phosphatase)主要表達(dá)于造血系統(tǒng)，參與正常造血調(diào)控特別是髓系細(xì)胞的發(fā)生，是PI3K/Akt通路重要的負(fù)調(diào)控因子。SHIP經(jīng)過(guò)催化磷脂酰肌醇D-5位磷酸脫磷酸化，將PI

3、P3降解為磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸[PI(3，4)P2]，從而下調(diào)PI3K下游的信號(hào)傳導(dǎo)。SHIP可通過(guò)抑制PI3K/Akt/GSK-3β途徑影響細(xì)胞周期，使細(xì)胞阻滯于G1期[1]。近來(lái)研究表明，SHIP基因突變?cè)诎籽“l(fā)病中占據(jù)了重要地位。將小鼠SHIP基因敲除后，出現(xiàn)骨髓細(xì)胞高度增生、肝脾腫大以及重要臟器骨髓細(xì)胞浸潤(rùn)等類似人類慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的現(xiàn)象[2]。Metzner等[3]將SHIP基因轉(zhuǎn)染到幼年型粒單核細(xì)胞白血?。?/p>

4、JMML）患者外周血CD34+細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)GM-CSF依賴性的增殖及集落形成減少，推測(cè)SHIP可有效阻斷JMML前體細(xì)胞對(duì)GM-CSF的超敏性，因而可用于JMML的治療。
　　磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt/哺乳動(dòng)物雷帕霉素(mTOR)信號(hào)通路(PI3K/Akt/mTOR)在維持細(xì)胞的正常生理功能上發(fā)揮了重要的作用，它參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和代謝等過(guò)程，是身體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。PI3K/AKT/mTOR在細(xì)胞的生長(zhǎng)和

5、存活的調(diào)節(jié)中經(jīng)常會(huì)失調(diào)，該途徑可以在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)和慢性髓細(xì)胞性白血病(CML)，以及在一些兒童淋巴瘤和淋巴組織增生性疾病中異常激活。PI3K可催化磷脂酰肌醇D-3位磷酸化，將PI-4-P和PI-4，5-P2分別轉(zhuǎn)化為PI-3，4-P2和PI-3，4，5-P3，PIP2和PIP3在此通路中作為第二信使能激活通路下游的分子蛋白激酶B(PKB/Akt)[4]，進(jìn)一步參與細(xì)胞增殖、凋亡等過(guò)程。在急性

6、白血病中，可以見(jiàn)到PI3K/Akt信號(hào)途徑的頻繁激活，PI3K通過(guò)磷酸化Akt中的Ser473和Thr308，進(jìn)一步激活其下游的多種效應(yīng)因子[5，6]。mTOR是PI3K/Akt通路下游的主要作用分子之一，mTOR與PI3K具有高度相似的催化性結(jié)構(gòu)域，因此它是磷酸肌醇3激酶相關(guān)激酶家族的成員。mTOR主要通過(guò)其下游兩個(gè)與翻譯有關(guān)的蛋白4EBP1和p70S6K1(S6K1)發(fā)揮作用。4EBP1是真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E)的抑制

7、性因子，經(jīng)過(guò)與eIF4E結(jié)合進(jìn)而影響蛋白質(zhì)合成。因此，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，可能在白血病的發(fā)生發(fā)展以及耐藥方面具有重要地位，有望成為治療白血病的有效靶點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)擬在探討CML患者骨髓白血病細(xì)胞SHIP及4EBP1的表達(dá)情況。進(jìn)一步研究SHIP基因在慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)病中所發(fā)揮的作用，為白血病的基因治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1采集慢性粒細(xì)胞白血病慢性期(CML-CP)及急

8、變期(CML-BP)患者骨髓液標(biāo)本(2-4ml)，骨髓標(biāo)本均來(lái)自于2012-2013年河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液科住院病人共27例，第一實(shí)驗(yàn)組為CML-CP，共17例，第二實(shí)驗(yàn)組為CML-BP，共10例，所有患者經(jīng)過(guò)MICM即形態(tài)學(xué)(Morphology,M)、免疫學(xué)(Immunology,I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(Cytoge-netic，C)和分子遺傳學(xué)(Moleculargenetics，M)診斷，符合FAB慢性粒細(xì)胞白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。10

9、例健康志愿者作為正常對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組共27例，包括男15例，女12例，年齡21-67歲，中位年齡44歲，對(duì)照組共10例，男5例，女5例，年齡25-50歲，中位年齡36歲，所有骨髓標(biāo)本提取單個(gè)核細(xì)胞，-80℃冰箱保存;
　　2 realtime-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SHIP及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)分子(4EBP1)mRNA水平的表達(dá)情況;
　　3 Western Blot法檢測(cè)SHIP及4EBP1在蛋白水平上的表

10、達(dá);
　　4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1本實(shí)驗(yàn)所收集的37例臨床標(biāo)本中SHIP基因和4EBP1基因在蛋白和mRNA水平均有表達(dá)。
　　2 SHIP基因mRNA表達(dá)水平realtime-PCR結(jié)果顯示慢性粒細(xì)胞白血病慢性期及急變期SHIP基因mRNA表達(dá)水平均比正常對(duì)照組表達(dá)水平降低(P＜0.01)，且急變期SHIP基因mRNA表達(dá)水平比慢性期表達(dá)水平降低(P＜0.01)。
　　34E-BP1基因mR

11、NA表達(dá)水平realtime-PCR結(jié)果顯示慢性粒細(xì)胞白血病慢性期和急變期4EBP1基因表達(dá)水平均比正常對(duì)照組表達(dá)水平增高(P＜0.01)，且急變期4EBP1基因表達(dá)水平比慢性期表達(dá)水平增高(P＜0.01)。
　　4 SHIP蛋白的表達(dá)水平 Western結(jié)果顯示，慢性粒細(xì)胞白血病慢性期和急變期SHIP蛋白表達(dá)水平均比正常對(duì)照組表達(dá)水平降低(P＜0.01)，且急變期SHIP蛋白水平比慢性期蛋白水平降低(P＜0.01)。
　　

12、54E-BP1蛋白的表達(dá)水平 Western結(jié)果顯示，慢性粒細(xì)胞白血病慢性期和急變期4EBP1蛋白表達(dá)水平均比正常對(duì)照組表達(dá)水平增高(P＜0.01)，且急變期4EBP1蛋白水平比慢性期蛋白水平增高(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1 SHIP基因mRNA表達(dá)水平隨著CML的病程進(jìn)展呈降低趨勢(shì)，蛋白表達(dá)水平相一致，考慮SHIP基因的表達(dá)與CML的進(jìn)展相關(guān)。
　　24EBP1基因 mRNA表達(dá)水平隨著CML的病程進(jìn)展呈升