循環(huán)miRNA作為肝癌及肝移植術(shù)后排異分子標(biāo)記物的研究.pdf

1、1993年，Ambros和同事在秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了第一個microRNA-lin-4。Ambros的研究發(fā)現(xiàn)，lin-4這一控制線蟲發(fā)育時相的基因并不編碼蛋白質(zhì)，而是合成兩個小的RNA分子。其中一個長度約22nt，另一個約61nt。較長的小RNA呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是較短者的前體。到2001年，Science雜志首次使用成熟miRNA這個單詞描述這些小片段RNA，并率先發(fā)現(xiàn)miRNA種類

2、繁多，是由一系列小調(diào)節(jié)RNA組成的。在不同物種間這些小調(diào)節(jié)RNA的種類和序列有所差別。隨后許多實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了更多miRNA，其家族成員迅速增大。miRNA具有以下四個特征:第一，成熟體為大約22 nt長度的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物;第二，成熟的miRNA來自具有特征性莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的前體;第三，成熟miRNA由Dicer酶加工而成;第四，成熟的miRNA以及其具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體在物種之間具有保守性。
　　單鏈形式的miRNA主要通過形成沉默復(fù)合體

3、(RNA-induced silencingcomplexes，RISCs)誘導(dǎo)染色體或基因沉默。miRNA通過調(diào)控基因表達(dá)，可產(chǎn)生包括控制細(xì)胞生長、增殖、凋亡、應(yīng)激等廣泛的生物學(xué)作用。miRNA與腫瘤關(guān)系密切，可能發(fā)揮著類似癌基因或抑癌基因的作用。雖然對已知miRNA分子的功能和作用機(jī)制了解甚少，但隨著檢測技術(shù)的不斷完善，通過在不同組織中檢測miRNA的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)譜具有明顯的組織特異性。在不同的疾病狀態(tài)下其表達(dá)譜改變具

4、有自身的特性，尤其是在腫瘤組織中。這些特點(diǎn)使得miRNA成為極具前景的新的腫瘤診斷分子標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。
　　然而，腫瘤組織水平的分子標(biāo)記物由于受標(biāo)本的限制，僅適合用于術(shù)后指導(dǎo)個體化治療，而無法作為早期診斷的分子。優(yōu)秀的早期診斷分子標(biāo)記物應(yīng)具備以下三個特征:一，具有疾病特異性;二，自身穩(wěn)定不易降解;三，標(biāo)本獲取方便易于檢測。
　　一直以來，RNA都被認(rèn)為是極其不穩(wěn)定的分子，容易被環(huán)境中的RNA酶迅速降解。最新的研究表明，mi

5、RNA可穩(wěn)定存在于外周血中。并且在外周血中的表達(dá)水平與疾病狀態(tài)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能抵抗RNA酶的降解，穩(wěn)定存在于外周血中。因此循環(huán)miRNA是一個具有巨大前景的疾病分子標(biāo)記物。
　　肝細(xì)胞肝癌（以下簡稱肝癌）是死亡率排在第三位的惡性腫瘤。其惡性程度高，被稱為“癌中之王”。肝癌起病極為隱匿，5年生存率只有7％左右，超過60％的肝癌患者在首次就診時已經(jīng)進(jìn)入晚期，從而失去根治性治療的機(jī)會。目前臨床上常用的肝癌早期診斷標(biāo)記物為

6、甲胎蛋白(Alpha Fetoprotein，AFP)。然而，AFP診斷肝癌的敏感度和特異度并不理想。在妊娠婦女、急慢性肝炎、生殖細(xì)胞腫瘤、先天性膽管閉塞、消化道腫瘤等人群中甲胎蛋白亦可能升高。而大約30-40％的肝癌患者AFP并不升高。因此尋找準(zhǔn)確有效的早期診斷方法可能是提高肝癌生存率的關(guān)鍵。而循環(huán)miRNA定量研究需要穩(wěn)定的內(nèi)參照，目前肝癌循環(huán)miRNA的研究尚無公認(rèn)的內(nèi)參照可用。這導(dǎo)致相同的疾病不同的實(shí)驗(yàn)室研究的結(jié)果變異大，各研究

7、結(jié)果缺乏兼容性無法互相比較。因此尋找循環(huán)miRNA穩(wěn)定內(nèi)參照是目前研究的首要任務(wù)。
　　肝癌是許多慢性終末期肝病發(fā)展的最終結(jié)局。大部分肝癌患者均伴有基礎(chǔ)肝病，乙肝-肝硬化-肝癌被稱為“肝癌三部曲”。手術(shù)切除只能切除腫瘤，殘留的病肝是患者日后復(fù)發(fā)的溫床。而肝移植能夠切除腫瘤和硬化的肝臟，同時消除了肝癌和其賴以生存“土壤”。并且肝移植是終末期肝病唯一的根治性方法。雖然免疫抑制劑發(fā)展迅速，目前仍有20-40％的病人術(shù)后出現(xiàn)急性排異。移植

8、術(shù)后的排異成為導(dǎo)致移植肝臟失去功能的重要因素，因此對于肝移植術(shù)后排異的有效監(jiān)測是提高移植肝存活率、延長生存時間的重要手段。
　　根據(jù)Anglicheau提出的時間軸模型，在疾病的發(fā)展過程中，最早發(fā)生分子生物學(xué)的改變，然后出現(xiàn)病理形態(tài)學(xué)改變，而臨床癥狀是疾病晚期的表現(xiàn)。分子標(biāo)記物較于病理、影像學(xué)檢查更能早期監(jiān)測到疾病的發(fā)生發(fā)展。外周血樣本采集方便、可動態(tài)連續(xù)檢測、能反映機(jī)體的內(nèi)環(huán)境生理和病理變化。因此，血清/血漿分子標(biāo)記物是臨床首選

9、的檢驗(yàn)靶標(biāo)。本研究擬通過高通量芯片和實(shí)時定量熒光RT-PCR，結(jié)合動物模型篩選驗(yàn)證肝癌早期診斷、肝移植排異相關(guān)的miRNA分子。以期為肝癌外科提供準(zhǔn)確有效的外周血miRNA分子標(biāo)記物。
　　第一部分循環(huán)miRNA穩(wěn)定內(nèi)參照的篩選及應(yīng)用
　　背景和目的:參照是基因表達(dá)水平定量的基礎(chǔ)和前提。參照又分為內(nèi)參照和外參照，內(nèi)參照是目前普遍采用的基因定量矯正方法。內(nèi)參照可以去除外界因素以及患者自身狀態(tài)導(dǎo)致的檢測干擾，從而將真正的表達(dá)差異

10、真實(shí)地呈現(xiàn)。循環(huán)miRNA的研究近年才開展，目前尚無公認(rèn)的內(nèi)參照。本研究擬通過高通量芯片及實(shí)時定量熒光RT-PCR法從血漿miRNA譜中篩選并驗(yàn)證穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參miRNA。
　　研究方法:本研究采用含723種人類miRNA探針的安捷倫公司人miRNA芯片V2（Agilent Human MiRNA Microarray V2）獲取肝癌患者和對照人群的血漿miRNA譜。其中健康人33例，慢性乙肝患者22例，乙肝肝硬化患者25例，肝癌

11、患者57例。在對照組中還加入了另外兩種腫瘤患者（結(jié)腸癌41例，肺癌73例）。芯片信號值分為三組，分別為:0-10;10-100;＞100。計(jì)算發(fā)現(xiàn)所有樣本全部miRNA的平均信號為16，在10-100組范圍內(nèi)。因此挑選在各組人群中平均信號值在10-100的miRNA。用變異系數(shù)權(quán)重法挑選出最穩(wěn)定的5個miRNA，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道常用的4個miRNA進(jìn)入下一步qRT-PCR的驗(yàn)證。驗(yàn)證組包括健康人30例，慢性乙肝31例，肝硬化31例，肝癌31

12、例，結(jié)腸癌31例，肺癌30例。通過變異系數(shù)、geNorm、NormFinder軟件對前期挑選的9個miRNA進(jìn)行穩(wěn)定性分析，確定最穩(wěn)定血漿miRNA。挑選另外5種發(fā)病率較高的腫瘤人群（包括食管癌23例;胃癌21例;腎癌24例;前列腺癌20例;乳腺癌21例）檢測挑選出的最小變異內(nèi)參照的表達(dá)值和變異系數(shù)，進(jìn)一步評估選定的血漿內(nèi)參miRNA的表達(dá)穩(wěn)定性。在證實(shí)該內(nèi)參miRNA的穩(wěn)定性后，應(yīng)用該穩(wěn)定內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化肝癌循環(huán)miRNA的表達(dá)值，進(jìn)行肝癌

13、相關(guān)循環(huán)miRNA的定量。并檢驗(yàn)肝癌相關(guān)循環(huán)miRNA診斷早期肝癌和AFP陰性肝癌的準(zhǔn)確性。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:芯片結(jié)果篩選獲得了21個信號值在10-100的血漿miRNA。通過變異系數(shù)權(quán)重法最終獲得了5個候選miRN(miR-1225-3p，miR-1228，miR-30d，miR-939，miR-940)。結(jié)合文獻(xiàn)檢索選取的4個應(yīng)用較多的血漿miRNA(miR-16，miR-223,let-7a，RNU6B)，一共9個血漿miRN

14、A進(jìn)入下一輪驗(yàn)證。qRT- PCR在184例驗(yàn)證組血漿中進(jìn)一步檢測后發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)最小的為miR-1228（平均變異系數(shù)前5位分別是miR-1228=4.5％; miR1225-3p=5.6％; miR-939=6.6％; miR-13d=7.8％; miR-223=9.3％）。NormFinder分析顯示miR-1228為最穩(wěn)定的血漿miRNA(穩(wěn)定系數(shù)前5位分別為:miR-1228=0.720;miR-30d=0.814; miR-9

15、39=0.875; miR-1225-3p=0.907;miR-16=0.999)。 geNorm分析亦顯示miR-1228穩(wěn)定性最佳(M值前5位為miR-1228=2.631; miR-30d=2.895; miR-1225-3p=2.986; miR-939=3.045;miR-16=3.094)。進(jìn)一步擴(kuò)大腫瘤人群發(fā)現(xiàn)，miR-1228在另外5種發(fā)病率較高的腫瘤患者血漿中（食管癌、胃癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌）表達(dá)分布與前述人群類

16、似，變異系數(shù)為5.5％。用miR-1228作為內(nèi)參后，篩選到肝癌相關(guān)循環(huán)miRNA，其診斷早期肝癌和AFP陰性肝癌的AUC分別為0.888和0.879。
　　結(jié)論:miR-1228在血漿總miRNA譜里的表達(dá)水平居中，在健康人、慢性乙肝、乙肝肝硬化和肝癌人群中穩(wěn)定表達(dá)，不因疾病狀態(tài)改變而發(fā)生改變。因此，miR-1228可以作為肝癌人群循環(huán)miRNA定量的穩(wěn)定內(nèi)參照，并且也是潛在的腫瘤患者循環(huán)miRNA定量的內(nèi)參照。
　　第二

17、部分循環(huán)miRNA監(jiān)測肝移植術(shù)后急性排異
　　背景和目的:大部分肝癌患者均伴有基礎(chǔ)肝病，肝移植能夠切除腫瘤和硬化的肝臟，同時消除了腫瘤和其賴以生存“土壤”。并且肝移植是終末期肝病唯一的根治性方法。然而，移植術(shù)后的排異成為導(dǎo)致移植肝臟失去功能的重要因素。本研究擬通過高通量芯片、qRT-PCR和動物模型篩選出急性排異相關(guān)的循環(huán)miRNA。
　　研究方法:建立大鼠原位肝移植模型(Lewis-BN，BN-BN)。排異組采用Lewis

18、大鼠作為供體，BN大鼠作為受體;非排異組用BN大鼠作為供、受體。首先使用安捷倫大鼠miRNA芯片檢測術(shù)后第7天排異組(n=4)和非排異組(n=4)血漿循環(huán)miRNA及肝臟組織miRNA表達(dá)譜。Genespring分析表達(dá)差異，挑選P＜0.005、倍數(shù)改變＞2且同時在血漿和肝臟組織均有改變的miRNA。挑選的差異miRNA在另一組大鼠模型中用qRT-PCR驗(yàn)證，并增加免疫抑制治療組（排異+FK506、排異+延遲FK506），分別在移植術(shù)后

19、3、7、10天動態(tài)監(jiān)測血漿miRNA的改變情況，檢測血清ALT水平作為對比。構(gòu)建四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷模型，檢測排異時相關(guān)循環(huán)miRNA在該模型中的表達(dá)改變。同時用另一種大鼠急性排異模型(ACI-Lewis)，以及肝移植后免疫耐受大鼠模型(B N-Lewis)進(jìn)一步觀察循環(huán)miRNA與排異的關(guān)系。為研究排異相關(guān)循環(huán)miRNA的來源，我們檢測對比排異組和非排異組大鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦和外周血淋巴細(xì)胞(Peripheral bloo

20、d mononuclear cells，PMBCs)等組織和器官排異相關(guān)miRNA的表達(dá)差異，在表達(dá)差異的器官進(jìn)一步用miRNA原位雜交法（In situ hybridization，ISH）觀察其表達(dá)分布。抽提血漿微囊泡檢測排異相關(guān)miRNA表達(dá)水平，探討排異相關(guān)的循環(huán)miRNA來源。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過芯片檢測，我們發(fā)現(xiàn)共有133個miRNA在肝移植大鼠的血漿中有表達(dá)。Genespring分析表達(dá)差異，選取在血漿和肝臟組織均有

21、改變的miRNA，共獲得9個差異miRNA。用qRT-PCR在另一組大鼠模型中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-122、miR-192和miR-146a在排異發(fā)生時顯著上調(diào)[P＜0.005、倍數(shù)改變(Fold chang，F(xiàn)C＞2)，并且其上調(diào)過程可以被免疫抑制劑所抑制。在四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠模型中我們也觀察到了循環(huán)miR-122(FC=22.126， P＜0.002)和miR-192(FC=8.833; P＜0.001)的升高，而循環(huán)mi

22、R-146a并無改變(FC=1.181;P=0.594)。檢測排異組和非排異組的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腦和PMBCs中miR-122、miR-192和miR-146a的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)除了肝臟其余組織均未出現(xiàn)差異表達(dá)。進(jìn)一步的miRNA ISH顯示miR-146a在排異大鼠肝臟的匯管區(qū)高表達(dá)，這一區(qū)域伴有大量淋巴細(xì)胞浸潤，而肝細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)在排異組和非排異組無明顯差異。微囊泡中miRNA檢測發(fā)現(xiàn)，排異組miR-14

23、6a顯著高于無排異組(P＜0.001)，而miR-122、miR-192的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:我們首次描繪出肝移植大鼠的循環(huán)miRNA譜。通過多模型驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)排異大鼠具有不同的外周血循環(huán)miRNA表達(dá)。循環(huán)miR-122和miR-192可能只反映肝臟的損傷狀態(tài)，而miR-146a可能是排異特異性miRNA。升高的循環(huán)miR-146a可能來源于排異肝臟中的淋巴細(xì)胞，并以微囊泡包裹的形式主動釋放入血。聯(lián)合檢測循環(huán)miR-1